【摘要】：研究目的主動脈夾層(aortic dissection,AD)是嚴重威脅人類生命健康的一類心血管系統(tǒng)疾病,因其發(fā)病具有急、險、重的特點,發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢,受到了國內(nèi)外研究者的重視,因此迫切需要對疾病更深入的研究和認識,然而其發(fā)病機制尚未完全闡明。本課題擬通過臨床樣本分析及動物實驗研究,以血管micro RNA-224的異常表達與主動脈管壁的生物力學(xué)性質(zhì)為著眼點,深入探討主動脈夾層發(fā)生發(fā)展的機制和干預(yù)策略,從基因與生物力學(xué)的層面為研究主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸提供科學(xué)性的理論依據(jù)。同時,本研究將可能為主動脈夾層的早期診斷、預(yù)防和治療提供新的靶標和策略。研究方法通過生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)mi R-224對多種主動脈管壁力學(xué)相關(guān)基因、蛋白具有調(diào)控作用,篩選并確定以mi R-224為研究靶標并進一步驗證其與主動脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)變化的關(guān)系。首先,在符合倫理學(xué)審查及患者知情同意前提下,采集正常捐獻者主動脈組織6例,胸主動脈夾層患者主動脈6例;對所有主動脈組織樣本按照標準流程提取總RNA,采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測樣本中mi R-224表達含量;而后將主動脈組織精細切割成長約15mm的啞鈴狀式樣,進行單軸力學(xué)拉伸測試,獲得應(yīng)力應(yīng)變曲線,極限應(yīng)力,極限應(yīng)變等力學(xué)指標,并比較mi R-224表達含量與主動脈管壁力學(xué)性質(zhì)變化的關(guān)系;為進一步驗證干預(yù)mi R-224表達后主動脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)的變化情況,采用飲食中添加β-氨基丙腈及皮下植入血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)微泵的FVB小鼠建立主動脈夾層模型,通過尾靜脈注射mi R-224Agomir/antagomir 15OD/只,分別設(shè)立空白對照組、普通造模組、mi R-224上調(diào)表達組、mi R-224上調(diào)對照組、mi R-224下調(diào)表達組、mi R-224下調(diào)對照組,研究mi R-224對血管重構(gòu)和主動脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)的影響;實驗結(jié)束處死小鼠,解剖分離小鼠主動脈,并在大體解剖層面觀察統(tǒng)計主動脈夾層病變發(fā)生情況,將小鼠主動脈分為4段,4%多聚甲醛固定石蠟包埋切片,HE染色測量小鼠主動脈管壁厚度(Aortic wall thickness);EVG染色比較小鼠主動脈彈力纖維變化,Masson染色檢測小鼠主動脈膠原纖維變化;通過q RT-PCR檢測驗證干預(yù)mi R-224后表達含量;免疫組織化學(xué)方法檢測力學(xué)相關(guān)蛋白Rho、ROCK1、SMAD表達變化;采用Electroforce 5500動態(tài)力學(xué)試驗機對小鼠主動脈管壁進行單軸拉伸力學(xué)測試,記錄并比較應(yīng)力(Stress)、應(yīng)變(Strain)、極限應(yīng)力(Failure Stress)、極限應(yīng)變(Failure Strain)、獲得應(yīng)力應(yīng)變曲線(stress-strain curve)計算彈性模量(Elastic modulus)及剛度(Stiffness)等力學(xué)參數(shù),通過線性擬合分析不同應(yīng)變條件下對應(yīng)彈性模量的變化情況,計算應(yīng)力-應(yīng)變曲線下面積(AUC),研究并明確干預(yù)mi R-224對主動脈管壁力學(xué)性質(zhì)變化的影響。結(jié)果臨床樣本研究,我們通過RT-PCR技術(shù)在胸主動脈夾層患者(n=6)與遺體捐獻者(正常人)(n=6)樣本上進行差異表達檢測發(fā)現(xiàn)mi R-224在主動脈夾層患者表達呈現(xiàn)顯著上調(diào)特征(P0.05),分別對主動脈夾層患者及正常捐獻者主動脈進行單軸拉伸力學(xué)測試,結(jié)果表明,夾層組較正常組極限荷載,極限位移,極限應(yīng)力、極限應(yīng)變明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)初始彈性模量(Initial elastic module)夾層組較正常組顯著降低(P0.01),極限彈性模量(Maxl elastic module)兩組間無明顯差異(P0.05);動物實驗結(jié)果顯示:造模后主動脈夾層發(fā)生率分別為,空白對照組(n=0/11,0)、普通造模組(5/12,41.67%)、mi R-224下調(diào)組(3/12,25%)、mi R-224下調(diào)對照組(4/12,33.32%)、mi R-224上調(diào)組(6/11,54.54%)、mi R-224上調(diào)對照組(5/11,45.45%),經(jīng)統(tǒng)計分析,mi R-224上調(diào)組小鼠主動脈夾層發(fā)生率較普通造模組顯著增高(6/11 vs 5/12,P0.01)mi R-224下調(diào)組小鼠主動脈夾層發(fā)生率較普通造模組顯著降低(3/12 vs 5/12,P0.01);通過q RT-PCR驗證表明mir-224agomir可顯著促進小鼠主動脈mi R-224的表達mir-224 antagomir可顯著抑制小鼠主動脈mi R-224的表達(P0.05);對小鼠主動脈管壁進行力學(xué)測試結(jié)果顯示:較空白對照組,主動脈夾層造模組、mi R-224上調(diào)、mi R-224上調(diào)對照組、mi R-224下調(diào)組、mi R-224下調(diào)對照組主動脈管壁厚度明顯增厚(P0.05),上調(diào)組較下調(diào)組管壁平均厚度顯著增加(P0.05),mi R-224低表達較mi R-224高表達能夠提高主動脈管壁的極限荷載、極限應(yīng)力、初始彈性模量、極限彈性模量,應(yīng)力-應(yīng)變曲線下面積(AUC)平均值,但是極限位移、拉伸比管壁平均周長兩組間無明顯差異(P0.05);EVG染色分析提示上調(diào)mi R-224較對照組使小鼠主動脈彈力纖維減少,結(jié)構(gòu)紊亂,甚至斷裂,Masson染色分析表明mi R-224下調(diào)可增加小鼠主動脈彈力纖維及膠原纖維含量,這表明下調(diào)mi R-224在夾層發(fā)生中具有保護性作用,而免疫組化結(jié)果提示小鼠主動脈組織中mi R-224上調(diào)組較對照組其力學(xué)相關(guān)Rho、ROCK1、SMAD等信號表達明顯增強(P0.05)。結(jié)論我們首次探討了mi R-224在主動脈夾層中表達的差異性同管壁生物力學(xué)性質(zhì)之間的聯(lián)系,明確了其與夾層發(fā)生中的關(guān)系,并在此基礎(chǔ)上通過動態(tài)力學(xué)測試儀進行了人主動脈樣本生物力學(xué)性質(zhì)的檢測,RT-PCR驗證得出mi R-224在主動脈夾層患者中呈高表達,同時我們測得人主動脈夾層患者的管壁力學(xué)各項指標如管壁厚度、初始彈性模量、極限應(yīng)力、極限應(yīng)變等較正常組織捐獻者明顯降低,提示mi R-224高表達及主動脈管壁力學(xué)性質(zhì)的差異與主動脈夾層形成關(guān)系密切。進一步的動物實驗結(jié)果表明,干預(yù)上調(diào)mi R-224基因表達后小鼠主動脈夾層的發(fā)生率明顯增高,而下調(diào)mi R-224表達后夾層發(fā)生率明顯降低,并且提示mi R-224為主動脈夾層發(fā)生的促進因素,高表達的mi R-224可以顯著降低主動脈管壁極限應(yīng)力、極限應(yīng)變,初始彈性模量、應(yīng)力應(yīng)變曲線下面積等生物力學(xué)指標,促使管壁彈力纖維、膠原纖維含量減低,免疫組化結(jié)果提示其可能通過Rho\ROCK1、SMAD等信號通路發(fā)揮作用,從而進一步導(dǎo)致主動脈夾層的發(fā)展。本研究將為主動脈夾層的早期診斷、預(yù)防和治療提供新的靶標和研究方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R543.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 William C.S.Cho;;MicroRNAs: Mechanisms, Functions and Progress[J];Genomics, Proteomics & Bioinformatics;2012年05期

2 秦永林,景在平;主動脈組織結(jié)構(gòu)與主動脈夾層形成關(guān)系的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊;2005年04期

，

本文編號：2272729