【摘要】：研究目的主動(dòng)脈夾層(aortic dissection,AD)是嚴(yán)重威脅人類生命健康的一類心血管系統(tǒng)疾病,因其發(fā)病具有急、險(xiǎn)、重的特點(diǎn),發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì),受到了國(guó)內(nèi)外研究者的重視,因此迫切需要對(duì)疾病更深入的研究和認(rèn)識(shí),然而其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。本課題擬通過(guò)臨床樣本分析及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,以血管micro RNA-224的異常表達(dá)與主動(dòng)脈管壁的生物力學(xué)性質(zhì)為著眼點(diǎn),深入探討主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展的機(jī)制和干預(yù)策略,從基因與生物力學(xué)的層面為研究主動(dòng)脈夾層的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸提供科學(xué)性的理論依據(jù)。同時(shí),本研究將可能為主動(dòng)脈夾層的早期診斷、預(yù)防和治療提供新的靶標(biāo)和策略。研究方法通過(guò)生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)mi R-224對(duì)多種主動(dòng)脈管壁力學(xué)相關(guān)基因、蛋白具有調(diào)控作用,篩選并確定以mi R-224為研究靶標(biāo)并進(jìn)一步驗(yàn)證其與主動(dòng)脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)變化的關(guān)系。首先,在符合倫理學(xué)審查及患者知情同意前提下,采集正常捐獻(xiàn)者主動(dòng)脈組織6例,胸主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈6例;對(duì)所有主動(dòng)脈組織樣本按照標(biāo)準(zhǔn)流程提取總RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)樣本中mi R-224表達(dá)含量;而后將主動(dòng)脈組織精細(xì)切割成長(zhǎng)約15mm的啞鈴狀式樣,進(jìn)行單軸力學(xué)拉伸測(cè)試,獲得應(yīng)力應(yīng)變曲線,極限應(yīng)力,極限應(yīng)變等力學(xué)指標(biāo),并比較mi R-224表達(dá)含量與主動(dòng)脈管壁力學(xué)性質(zhì)變化的關(guān)系;為進(jìn)一步驗(yàn)證干預(yù)mi R-224表達(dá)后主動(dòng)脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)的變化情況,采用飲食中添加β-氨基丙腈及皮下植入血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)微泵的FVB小鼠建立主動(dòng)脈夾層模型,通過(guò)尾靜脈注射mi R-224Agomir/antagomir 15OD/只,分別設(shè)立空白對(duì)照組、普通造模組、mi R-224上調(diào)表達(dá)組、mi R-224上調(diào)對(duì)照組、mi R-224下調(diào)表達(dá)組、mi R-224下調(diào)對(duì)照組,研究mi R-224對(duì)血管重構(gòu)和主動(dòng)脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)的影響;實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠,解剖分離小鼠主動(dòng)脈,并在大體解剖層面觀察統(tǒng)計(jì)主動(dòng)脈夾層病變發(fā)生情況,將小鼠主動(dòng)脈分為4段,4%多聚甲醛固定石蠟包埋切片,HE染色測(cè)量小鼠主動(dòng)脈管壁厚度(Aortic wall thickness);EVG染色比較小鼠主動(dòng)脈彈力纖維變化,Masson染色檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈膠原纖維變化;通過(guò)q RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證干預(yù)mi R-224后表達(dá)含量;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)力學(xué)相關(guān)蛋白R(shí)ho、ROCK1、SMAD表達(dá)變化;采用Electroforce 5500動(dòng)態(tài)力學(xué)試驗(yàn)機(jī)對(duì)小鼠主動(dòng)脈管壁進(jìn)行單軸拉伸力學(xué)測(cè)試,記錄并比較應(yīng)力(Stress)、應(yīng)變(Strain)、極限應(yīng)力(Failure Stress)、極限應(yīng)變(Failure Strain)、獲得應(yīng)力應(yīng)變曲線(stress-strain curve)計(jì)算彈性模量(Elastic modulus)及剛度(Stiffness)等力學(xué)參數(shù),通過(guò)線性擬合分析不同應(yīng)變條件下對(duì)應(yīng)彈性模量的變化情況,計(jì)算應(yīng)力-應(yīng)變曲線下面積(AUC),研究并明確干預(yù)mi R-224對(duì)主動(dòng)脈管壁力學(xué)性質(zhì)變化的影響。結(jié)果臨床樣本研究,我們通過(guò)RT-PCR技術(shù)在胸主動(dòng)脈夾層患者(n=6)與遺體捐獻(xiàn)者(正常人)(n=6)樣本上進(jìn)行差異表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mi R-224在主動(dòng)脈夾層患者表達(dá)呈現(xiàn)顯著上調(diào)特征(P0.05),分別對(duì)主動(dòng)脈夾層患者及正常捐獻(xiàn)者主動(dòng)脈進(jìn)行單軸拉伸力學(xué)測(cè)試,結(jié)果表明,夾層組較正常組極限荷載,極限位移,極限應(yīng)力、極限應(yīng)變明顯降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)初始彈性模量(Initial elastic module)夾層組較正常組顯著降低(P0.01),極限彈性模量(Maxl elastic module)兩組間無(wú)明顯差異(P0.05);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:造模后主動(dòng)脈夾層發(fā)生率分別為,空白對(duì)照組(n=0/11,0)、普通造模組(5/12,41.67%)、mi R-224下調(diào)組(3/12,25%)、mi R-224下調(diào)對(duì)照組(4/12,33.32%)、mi R-224上調(diào)組(6/11,54.54%)、mi R-224上調(diào)對(duì)照組(5/11,45.45%),經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,mi R-224上調(diào)組小鼠主動(dòng)脈夾層發(fā)生率較普通造模組顯著增高(6/11 vs 5/12,P0.01)mi R-224下調(diào)組小鼠主動(dòng)脈夾層發(fā)生率較普通造模組顯著降低(3/12 vs 5/12,P0.01);通過(guò)q RT-PCR驗(yàn)證表明mir-224agomir可顯著促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈mi R-224的表達(dá)mir-224 antagomir可顯著抑制小鼠主動(dòng)脈mi R-224的表達(dá)(P0.05);對(duì)小鼠主動(dòng)脈管壁進(jìn)行力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示:較空白對(duì)照組,主動(dòng)脈夾層造模組、mi R-224上調(diào)、mi R-224上調(diào)對(duì)照組、mi R-224下調(diào)組、mi R-224下調(diào)對(duì)照組主動(dòng)脈管壁厚度明顯增厚(P0.05),上調(diào)組較下調(diào)組管壁平均厚度顯著增加(P0.05),mi R-224低表達(dá)較mi R-224高表達(dá)能夠提高主動(dòng)脈管壁的極限荷載、極限應(yīng)力、初始彈性模量、極限彈性模量,應(yīng)力-應(yīng)變曲線下面積(AUC)平均值,但是極限位移、拉伸比管壁平均周長(zhǎng)兩組間無(wú)明顯差異(P0.05);EVG染色分析提示上調(diào)mi R-224較對(duì)照組使小鼠主動(dòng)脈彈力纖維減少,結(jié)構(gòu)紊亂,甚至斷裂,Masson染色分析表明mi R-224下調(diào)可增加小鼠主動(dòng)脈彈力纖維及膠原纖維含量,這表明下調(diào)mi R-224在夾層發(fā)生中具有保護(hù)性作用,而免疫組化結(jié)果提示小鼠主動(dòng)脈組織中mi R-224上調(diào)組較對(duì)照組其力學(xué)相關(guān)Rho、ROCK1、SMAD等信號(hào)表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.05)。結(jié)論我們首次探討了mi R-224在主動(dòng)脈夾層中表達(dá)的差異性同管壁生物力學(xué)性質(zhì)之間的聯(lián)系,明確了其與夾層發(fā)生中的關(guān)系,并在此基礎(chǔ)上通過(guò)動(dòng)態(tài)力學(xué)測(cè)試儀進(jìn)行了人主動(dòng)脈樣本生物力學(xué)性質(zhì)的檢測(cè),RT-PCR驗(yàn)證得出mi R-224在主動(dòng)脈夾層患者中呈高表達(dá),同時(shí)我們測(cè)得人主動(dòng)脈夾層患者的管壁力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)如管壁厚度、初始彈性模量、極限應(yīng)力、極限應(yīng)變等較正常組織捐獻(xiàn)者明顯降低,提示mi R-224高表達(dá)及主動(dòng)脈管壁力學(xué)性質(zhì)的差異與主動(dòng)脈夾層形成關(guān)系密切。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,干預(yù)上調(diào)mi R-224基因表達(dá)后小鼠主動(dòng)脈夾層的發(fā)生率明顯增高,而下調(diào)mi R-224表達(dá)后夾層發(fā)生率明顯降低,并且提示mi R-224為主動(dòng)脈夾層發(fā)生的促進(jìn)因素,高表達(dá)的mi R-224可以顯著降低主動(dòng)脈管壁極限應(yīng)力、極限應(yīng)變,初始彈性模量、應(yīng)力應(yīng)變曲線下面積等生物力學(xué)指標(biāo),促使管壁彈力纖維、膠原纖維含量減低,免疫組化結(jié)果提示其可能通過(guò)Rho\ROCK1、SMAD等信號(hào)通路發(fā)揮作用,從而進(jìn)一步導(dǎo)致主動(dòng)脈夾層的發(fā)展。本研究將為主動(dòng)脈夾層的早期診斷、預(yù)防和治療提供新的靶標(biāo)和研究方向。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R543.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：2272729