【摘要】：背景：急性冠脈事件發(fā)病兇險(xiǎn),嚴(yán)重威脅人們的生命。研究表明,約75%的急性冠脈事件是由不穩(wěn)定斑塊破裂引起的,因此發(fā)展早期識(shí)別此類(lèi)危險(xiǎn)斑塊的檢查方法,探討影響斑塊穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)機(jī)制,對(duì)急性心血管事件的防治具有重要意義。目前臨床上對(duì)不穩(wěn)定斑塊的識(shí)別主要是高分辨影像技術(shù),但其價(jià)格昂貴,不利于早期篩查；而循環(huán)血標(biāo)志物的檢查經(jīng)濟(jì)便捷,因而研究發(fā)現(xiàn)有效的不穩(wěn)定斑塊標(biāo)志物成為當(dāng)前的關(guān)注熱點(diǎn)�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類(lèi)具有鋅離子依賴性,降解膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的內(nèi)肽酶,不僅參與胚胎形成、血管新生和傷口愈合等生理過(guò)程,而且與組織重構(gòu)、腫瘤轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展等病理進(jìn)程密切相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)冠脈非鈣化斑塊患者的血清MMP-9水平顯著高于鈣化斑塊及無(wú)斑塊人群者,本研究擬在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大樣本量,進(jìn)一步確定MMP-9和MMP-2識(shí)別非鈣化斑塊的能力,同時(shí)以連續(xù)入選病例的方式模擬自然人群特征,利于將MMP-9和MMP-2對(duì)非鈣化斑塊人群早期篩查推廣應(yīng)用于臨床。在動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)程中,MMPs通過(guò)降解斑塊內(nèi)基質(zhì)成分,進(jìn)而使纖維帽變薄,最終導(dǎo)致斑塊破裂,因此探尋MMPs的調(diào)節(jié)分子及調(diào)控機(jī)制,可為穩(wěn)定斑塊纖維帽、防止斑塊破裂提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。溶血磷脂酸(LPA)是一種內(nèi)源性的生物活性磷脂信號(hào)分子,通過(guò)6種不同的G蛋白偶聯(lián)受體(LPA1～LPA6)發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。研究表明,LPA可誘導(dǎo)人卵巢癌,人腦膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞表達(dá)分泌MMPs參與侵襲過(guò)程,但是在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中,LPA在調(diào)節(jié)MMPs表達(dá)分泌的環(huán)節(jié)中扮演什么角色尚不清楚,LPA受體又能否成為穩(wěn)定纖維帽、防止斑塊破裂的干預(yù)靶點(diǎn),這些問(wèn)題均是本課題研究的重點(diǎn)。目的：①研究MMP-9和MMP-2作為血清標(biāo)志物識(shí)別非鈣化斑塊的可行性,為斑塊破裂誘發(fā)的心血管事件提供新的預(yù)防途徑和診斷工具,同時(shí)初步探索新型的斑塊不穩(wěn)定性相關(guān)的炎癥標(biāo)志物；②研究LPA對(duì)MMP-9的表達(dá)分泌的影響極其信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制,探索LPA信號(hào)與斑塊纖維帽的相關(guān)性,探討LPA受體或可成為穩(wěn)定斑塊纖維帽、防止斑塊破裂的新的干預(yù)靶點(diǎn)。方法：連續(xù)選取2012年7月-2014年2月在我院就診并進(jìn)行64排螺旋CT檢查的門(mén)診患者862例,聯(lián)合急性冠脈綜合征的典型臨床癥狀入組正常對(duì)照組474例、鈣化斑塊組159例、非鈣化斑塊組80例和混合斑塊組149例,采用ELISA方法檢測(cè)MMP-9和MMP-2的血清含量,分析其對(duì)非鈣化斑塊的診斷能力。從上述每組受試者中再隨機(jī)選取15例,進(jìn)行TNF-a、Eotaxin、PTX3 (pentraxin 3)、MPO (myeloperoxidase)等炎癥因子血清含量的測(cè)定,初步探索其作為斑塊不穩(wěn)定性的新型標(biāo)志物的可行性。利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)LPA生成酶ATX(autotaxin)和MMP-9在不同程度的人冠脈斑塊組織中的共定位情況,分別利用RT-PCR、Western Blot、ELISA和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LPA對(duì)MMP-9的表達(dá)、分泌水平和活性的影響。以相應(yīng)抑制劑處理細(xì)胞,采用熒光素酶報(bào)告基因分析,siRNA和miRNA轉(zhuǎn)染等技術(shù)闡明LPA通過(guò)多條信號(hào)通路調(diào)節(jié)MMP-9的機(jī)制。用SPSS17.0進(jìn)行分析,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：研究顯示血清MMP-9水平在非鈣化斑塊組明顯高于正常對(duì)照組、鈣化斑塊組和混合斑塊組(731.0±271.2 ng/mL vs 533.7±243.8 ng/mL,593.0±276.6 ng/mL,588.2±246.7 ng/mL, p0.001),其單獨(dú)識(shí)別非鈣化斑塊的ROC曲線下面積為0.70,且聯(lián)合其它指標(biāo)后識(shí)別能力未有增加。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),利用血清HDL-C水平分層后有助于MMP-9診斷價(jià)值的提高,在HDL-C≥1.55 mmol/L的患者中,血清MMP-9識(shí)別非鈣化斑塊的效能明顯增加,ROC曲線下面積為0.84。此外,本研究發(fā)現(xiàn)MMP-9聯(lián)合MMP-2和年齡因素診斷斑塊存在的ROC曲線下面積為0.72,HDL-C≥1.55 mmol/L的患者中,聯(lián)合診斷斑塊存在的曲線下面積增加至0.80。但在動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊相關(guān)的四種候選炎癥因子中,未能發(fā)現(xiàn)在正常對(duì)照組、鈣化斑塊組、非鈣化斑塊和混合斑塊組有差異表達(dá)的因子�；谝陨螹MP-9與斑塊穩(wěn)定性的密切關(guān)系,本研究后續(xù)對(duì)MMP-9的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。人群研究表明急性冠脈綜合征患者LPA和MMP-9的外周血水平顯著高于正常人,并且二者具有相關(guān)性。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)在人冠脈斑塊組織中,LPA的生成酶ATX和MMP-9的含量隨斑塊不穩(wěn)定性的增加而升高,且二者存在共定位現(xiàn)象,提示LPA與MMP-9之間可能存在調(diào)節(jié)關(guān)系。在THP-1源性巨噬細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn),LPA對(duì)MMP-9的表達(dá)、分泌和活化的促進(jìn)作用呈劑量和時(shí)間依賴性,LPA 10μM處理24 h時(shí)促進(jìn)MMP-9的表達(dá)和分泌最為明顯,以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。利用放線菌素D和放線菌酮預(yù)處理細(xì)胞,分別抑制MMP-9 mRNA的新生和蛋白質(zhì)的合成,結(jié)果顯示LPA對(duì)MMP-9表達(dá)的促進(jìn)作用均受到抑制,表明LPA對(duì)MMP-9的上調(diào)作用發(fā)生在其mRNA的從頭合成階段,即轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道篩選出三個(gè)可能介導(dǎo)LPA調(diào)節(jié)MMP-9的轉(zhuǎn)錄因子：PPARγ、NF-κB和AP-1,分別采用相應(yīng)抑制劑GW9662、PDTC和Tan ⅡA處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)僅NF-κB介導(dǎo)了LPA促進(jìn)MMP-9表達(dá)的作用。利用U0126阻斷ERK1/2后,LPA上調(diào)MMP-9表達(dá)的效應(yīng)減弱,同樣抑制了LPA誘導(dǎo)NF-KB活性的升高,表明LPA通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性,從而上調(diào)MMP-9的表達(dá)。此外研究結(jié)果顯示,LPA可上調(diào)miR-21和miR-221的表達(dá),miRNAs inhibitor轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明miR-21參與巨噬細(xì)胞LPA上調(diào)MMP-9的表達(dá)。最后利用RNAi技術(shù)分別阻斷THP-1源性巨噬細(xì)胞主要表達(dá)的LPA1、LPA2和LPA6三種受體后發(fā)現(xiàn),敲低LPA2削弱LPA對(duì)MMP-9的促進(jìn)作用,揭示LPA2介導(dǎo)了LPA調(diào)節(jié)MMP-9的過(guò)程。結(jié)論：在高密度脂蛋白膽固醇偏高的人群中,MMP-9對(duì)非鈣化斑塊有較高的診斷效能,或可成為斑塊不穩(wěn)定性的生物標(biāo)志物,有望應(yīng)用于不穩(wěn)定斑塊的早期篩查,成為臨床常規(guī)檢測(cè)的一種診斷方法。LPA能夠誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞MMP-9的表達(dá),促進(jìn)其分泌及活化。LPA通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性,以及誘導(dǎo)miR-21的表達(dá),從而上調(diào)MMP-9的轉(zhuǎn)錄。本研究揭示了LPA可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性調(diào)節(jié)的新機(jī)制,LPA2受體亞型或可成為防止斑塊破裂和急性心血管事件發(fā)生的新的干預(yù)靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R541.4

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2268639