【摘要】：1研究背景動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是心血管疾病和卒中的主要病因。既往研究顯示動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊血栓形成及斑塊破裂可導(dǎo)致心肌梗死、卒中和猝死。因此,斑塊易損性已成為國(guó)內(nèi)外冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的研究熱點(diǎn)。炎癥是目前公認(rèn)的一個(gè)參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展,動(dòng)脈斑塊破裂和血栓形成的重要因素。其中,巨噬細(xì)胞是關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞,參與動(dòng)脈粥樣硬化的每一個(gè)階段,從斑塊形成,斑塊破裂到血栓形成,并廣泛存在于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中。巨噬細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子及多種炎癥因子,如白細(xì)胞介素6(Interleukin-6, IL-6),白細(xì)胞介素8 (Interleukin-8, IL-8),單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1),腫瘤壞死因子α (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)等。在這些炎癥因子的作用下,更多的單核細(xì)胞浸入內(nèi)皮下,加劇炎癥反應(yīng)并形成動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展期斑塊。此外,巨噬細(xì)胞對(duì)斑塊形態(tài)大小、壞死核心形成及“薄”纖維帽等易損斑塊特征性改變亦至關(guān)重要。因此,探究影響巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子是防治動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的關(guān)鍵。近年研究發(fā)現(xiàn),脂肪組織不僅是機(jī)體的能量貯存器官,更具有重要的內(nèi)分泌功能。脂肪細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子,包含脂聯(lián)素(Adiponectin, APN)、抗素(Resisting C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白(C1q/Tumor necrosis factor related proteins, CTRPs)等。其中,Clq腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9(C1q/Tumor necrosis factor related protein 9, CTRP9)是一種新型脂肪細(xì)胞因子,屬于腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白家族(CTRP)成員之一,且與APN高度同源。既往文獻(xiàn)報(bào)道,APN具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗凋亡、抗糖尿病等多種生物學(xué)功能,且與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性密切相關(guān)。最新研究顯示脂肪細(xì)胞因子CTRP9亦與心血管疾病密切相關(guān)。研究證實(shí)CTRP9可顯著降低血管平滑肌細(xì)胞的增殖和新生內(nèi)膜形成,并可誘導(dǎo)血管舒張。另?yè)?jù)臨床研究顯示,血清CTRP9水平與2型糖尿病患者血糖利用及動(dòng)脈僵硬度相關(guān)。本課題組前期研究顯示,血清CTRP9與急性冠脈綜合征顯著負(fù)相關(guān)。以上信息均提示CTRP9可能參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及發(fā)展。然而,CTRP9對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)及斑塊穩(wěn)定性的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。終上所述,這些科學(xué)問(wèn)題即構(gòu)成本課題的研究目的及設(shè)計(jì)思路。2研究目的(1)探討脂肪細(xì)胞因子CTRP9對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊穩(wěn)定性的影響；(2)闡明CTRP9促進(jìn)斑塊穩(wěn)定性作用的新靶點(diǎn)。3實(shí)驗(yàn)方法3.1動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠動(dòng)物模型構(gòu)建8周齡雄性ApoE-/-小鼠,全程高脂喂養(yǎng)(0.25%膽固醇和15%黃油),行右側(cè)頸總動(dòng)脈套管(內(nèi)徑0.33mm,外徑0.50mm,長(zhǎng)度2mm)置入術(shù),促進(jìn)頸動(dòng)脈斑塊形成。套管術(shù)后8周,隨機(jī)分為3組：LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組：頸靜脈注射攜帶CTRP9基因的慢病毒,病毒總量為2×107 TU/只,體積為100μL；LV-eGFP陰性病毒對(duì)照組：頸靜脈注射攜帶GFP基因的慢病毒,病毒總量為2×107 TU/只,體積為100μL；Vehicle空白對(duì)照組：頸靜脈注射等體積PBS稀釋液,體積為100μL。頸靜脈注射4周后,給予小鼠安樂(lè)死。3.2血糖,血脂檢測(cè)動(dòng)物處死前,空腹采血,收集血清,檢測(cè)血糖(GLU),游離脂肪酸(NEFA),甘油三酯(TG),總膽固醇(TC),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。3.3易損指數(shù)慢病毒轉(zhuǎn)染30天后取材。取小鼠右側(cè)頸動(dòng)脈制成冰凍標(biāo)本,5μm厚冰凍切片行特殊染色(HE染色、油紅O染色、天狼猩紅染色)；免疫組化染色方法檢測(cè)斑塊內(nèi)MOMA-2, α-SMA蛋白表達(dá)情況。Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性面積占動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積百分比。根據(jù)公式計(jì)算易損指數(shù)。易損指數(shù)=(巨噬細(xì)胞相對(duì)含量+脂質(zhì)相對(duì)含量)／(平滑肌相對(duì)含量+膠原相對(duì)含量)。3.4免疫組化免疫組化方法檢測(cè)斑塊局部炎癥因子表達(dá)：如TNF-α, MCP-1。Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性面積占動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積百分比。3.5細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞(培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS,溫度37℃,氣體條件5%CO2)。分別用攜帶CTRP9基因的慢病毒與攜帶GFP對(duì)照基因的慢病毒轉(zhuǎn)染RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞；72小時(shí)后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理轉(zhuǎn)染后細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24h,檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)變化。3.6 Western Blot收集細(xì)胞及培養(yǎng)基,并提取蛋白。應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞CTRP9蛋白表達(dá)水平及巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α和MCP-1蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用Image J軟件分析。3.7統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM.)表示,兩兩比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析(ANOVA)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,p0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4結(jié)果4.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.1.1 LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠血清CTRP9蛋白表達(dá)升高與LV-eGFP陰性對(duì)照組比較,LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠血清CTRP9水平升高3.9倍(p0.05);與Vehicle空白對(duì)照組比較,LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠血清CTRP9水平升高3.5倍(p0.05),而兩對(duì)照組間無(wú)顯著差異(p0.05)。4.1.2 LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖、血脂水平影響LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與LV-eGFP陰性病毒對(duì)照組小鼠比較,血清血糖水平下降(p0.05)；LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與Vehicle空白對(duì)照組小鼠比較,血清血糖水平下降(p0.05),而兩對(duì)照組間比較無(wú)顯著差異(p0.05)。LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與兩對(duì)照組小鼠比較,血脂水平未見(jiàn)顯著差異(p0.05)。4.1.3 CTRP9可增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與兩對(duì)照組小鼠比較,脂質(zhì)及巨噬細(xì)胞含量降低(p0.05),平滑肌及膠原含量增加(p0.05),斑塊易損指數(shù)下降(p0.05)；兩對(duì)照組間比較無(wú)顯著差異(p0.05)。4.1.4 CTRP9可減少斑塊局部炎癥因子表達(dá)LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與兩對(duì)照組小鼠比較,斑塊局部炎癥因子TNF-α和MCP-1蛋白表達(dá)下降(p0.05)；兩對(duì)照組間比較無(wú)顯著差異(p0.05)4.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.2.1 LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞及培養(yǎng)基中有CTRP9蛋白表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞,當(dāng)MOI=60時(shí),轉(zhuǎn)染效率近90%。與兩對(duì)照組比較,LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠巨噬細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)基中均可檢測(cè)到CTRP9蛋白。4.2.2 LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)降低與LV-eGFP組比較,LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-a和MCP-1表達(dá)降低(p0.05)。5結(jié)論(1)提高血清CTRP9蛋白水平可顯著降低斑塊局部脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞含量,增加膠原和平滑肌細(xì)胞含量,從而降低斑塊易損性；(2)體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)CTRP9可通過(guò)降低斑塊局部炎癥因子TNF-a和MCP-1的表達(dá),發(fā)揮抗炎,穩(wěn)定斑塊作用；(3)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)CTRP9可能通過(guò)減少巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-a和MCP-1,進(jìn)而降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn),發(fā)揮抗炎,穩(wěn)定斑塊作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：2257977