【摘要】：Nav1.5蛋白質(zhì)是形成心肌電壓門控的鈉通道復(fù)合體孔徑最主要的α亞基,所產(chǎn)生的鈉電流在心臟動作電位的產(chǎn)生以及傳導(dǎo)過程中起到非常關(guān)鍵的作用。Nav1.5蛋白在體內(nèi)存在于多蛋白復(fù)合體中,并通過與actin細胞骨架以及細胞外基質(zhì)相互作用為鈉通道復(fù)合體、心肌結(jié)構(gòu)以及電功能提供重要的功能橋梁作用。編碼Nav1.5的SCN5A基因突變能夠?qū)е乱幌盗羞z傳性心律失常疾病的產(chǎn)生,包括心房顫動、Brugada綜合征、長QT綜合征、進行性心臟傳導(dǎo)阻滯、病態(tài)竇房結(jié)綜合征以及擴張性心肌病。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多蛋白質(zhì)能夠結(jié)合Nav1.5。我們實驗室曾經(jīng)報導(dǎo)過一個在核質(zhì)蛋白運輸中起重要作用的小分子蛋白MOG1,能夠與Na,1.5直接相互作用并促進Nav1.5轉(zhuǎn)運至細胞膜,進而增大鈉通道電流密度。進一步研究發(fā)現(xiàn),MOG1促進Nav1.5從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運出并轉(zhuǎn)運至細胞膜上的小窩處。其他與Nav1.5存在相互作用的蛋白質(zhì)還包括4個p亞基、成纖維細胞生長因子同源因子1B、類似Nedd4的泛素化連接酶(Nedd4-2)、錨蛋白G、酪氨酸激酶Fyn、syntrophin、蛋白酪氨酸磷酸酶PTPH1以及14-3-3η等。大多數(shù)這些蛋白質(zhì)不僅僅結(jié)合Nav1.5還能影響其生理性質(zhì)。在心肌細胞中MOG1、錨蛋白G以及14-3-3η能夠調(diào)控Nav1.5在細胞膜上的定位.Nedd4-2通過與Nav1.5相互作用并調(diào)控Nav1.5的降解。然而Nav1.5蛋白復(fù)合體是高度復(fù)雜的,許多成員還待發(fā)現(xiàn)。基于此,該項目主要目標是發(fā)現(xiàn)其他新的Nav1.5蛋白復(fù)合體組分。在本研究中,通過酵母雙雜技術(shù)以及后續(xù)的一系列生化與分子生物學(xué)分析,我們確定aB-crystallin蛋白質(zhì)為Nav1.5新的相互作用蛋白。GST-pull down以及免疫共沉淀實驗驗證了aB-crystallin與Nav1.5的確存在相互作用。全細胞膜片鉗結(jié)果顯示高表達aB-crystallin能夠顯著地增大鈉通道電流密度,導(dǎo)致電流密度增大的分子機制是由于細胞膜上Nav1.5的表達增加。aB-crystallin通過減弱細胞膜上Nav1.5蛋白內(nèi)陷以及Nav1.5蛋白泛素化,導(dǎo)致細胞膜上Nav1.5的表達增加。敲低aB-crystallin蛋白的表達能夠顯著地降低Nav1.5蛋白在細胞膜上的表達。以前的研究報導(dǎo)Nav1.5蛋白泛素化通過泛素化連接酶Nedd4-2結(jié)合到Nav1.5蛋白質(zhì)C末端上的PY基序上介導(dǎo)完成。泛素化連接酶Nedd4-2能夠增加Nav1.5的泛素化以及減少鈉通道電流密度。考慮到αB-crystallin同樣能夠降低Nav1.5泛素化,因此檢測了αB-crystallin能否與Nedd4-2之間存在相互作用。免疫共沉淀結(jié)果分析顯示,αB-crystallin能夠與Nedd4-2相互作用,然而當(dāng)Nedd4-2蛋白催化活性位點突變后(Nedd4-2-CS),減弱了與αB-crystallin之間的相互作用。同時在Nedd4-2-CS存在下,αB-crystallin喪失了增大鈉通道電流密度的功能。當(dāng)Nav1.5蛋白突變?yōu)镹2vv1.5-V1980A后,降低了Nedd4-2與Nav1.5蛋白的相互作用,減少了Nav1.5蛋白泛素化,同樣使αB-crystallin喪失了增大鈉通道電流密度的功能。小分子熱休克蛋白αB-crystallin由CRYAB基因編碼,在許多組織中有廣泛表達,包括心臟、晶狀體以及骨骼肌。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CRYAB基因突變能夠?qū)е露喾N遺傳疾病的發(fā)生,包括白內(nèi)障、骨骼肌肌病以及心肌病等。我們發(fā)現(xiàn),其中2個αB-crystallin蛋白R109H以及R151X突變位點喪失了能夠增大鈉通道電流密度的功能。由于鈉通道電流密度減小與Brugada綜合征、進行性心臟傳導(dǎo)阻滯,病態(tài)竇房結(jié)綜合征以及房顫等疾病有關(guān),攜帶αB-crystallin蛋白R109H或者R151X突變位點的患者應(yīng)該注意可能伴發(fā)患有這些心律失常疾病的潛在風(fēng)險。本研究發(fā)現(xiàn)αB-crystallin是一個新的Nav1.5相互作用蛋白。αB-crystallin與Nav1.5蛋白相互作用,能夠通過改變細胞膜上Nav1.5蛋白的表達、內(nèi)陷以及Nav1.5蛋白的泛素化進而增大記錄的鈉通道電流密度,這些需要αB-crystallin與Nav1.5以及αB-crystallin與功能性Nedd4-2蛋白之間的相互作用�？紤]到鈉通道Nav1.5在心臟生理功能、心律失常以及猝死方面起到非常重要的作用,以及本研究發(fā)現(xiàn)αB-crystallin在調(diào)控N釓1.5功能中起到非常重要的作用,我們推測αB-crystallin在心臟生理功能、心律失常以及猝死方面也會起到同樣重要的作用。本研究同樣有助于為我們提供新的治療策略,為治療因鈉通道Nav1.5功能減弱引起的致命性心律失常疾病提供感興趣的潛在靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R541.7

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本文編號：2255023