【摘要】：冠狀動脈粥樣硬化性疾病是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)使管腔狹窄或阻塞,導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球疾病狀況評估報告顯示,過去十年因缺血性心臟病死亡的人數(shù)占人類疾病死亡總數(shù)的48.6%,位居首位。盡管目前通過及時有效PCI手術(shù)或者溶栓療法可以減少心梗面積并且改善臨床預(yù)后,但是這種再灌注療法在改善缺血心肌血流供給的同時會帶來另一種損傷,稱之為心臟缺血再灌注損傷。心臟缺血再灌注損傷的病理機制,主要認為與心肌鈣離子超載、活性氧的大量釋放、細胞內(nèi)酸堿平衡的波動以及炎癥反應(yīng)作用有關(guān),但是心臟缺血再灌注損傷的機制還需要進一步闡述。心臟缺血再灌注損傷通常分為四種類型:第一種為心肌細胞的頓抑,一種心肌在經(jīng)過短時缺血后恢復(fù)血液供應(yīng),心肌出現(xiàn)持續(xù)數(shù)天至數(shù)周的功能障礙,這一損傷通�？赡娌⑶易罱K冠脈血流可以恢復(fù)正常。心肌頓抑與心臟能量代謝障礙密切相關(guān);第二種為無復(fù)流現(xiàn)象,主要是由于心臟微循環(huán)在結(jié)構(gòu)或功能上的變化,使得灌注缺血區(qū)域的冠脈沒有血液供給;第三種為再灌注導(dǎo)致的心律失常;第四種為致死性再灌注損傷。溶血磷脂酰膽堿是一類含磷的類脂化合物,機體內(nèi)溶血磷脂酰膽堿主要來源于細胞膜的磷脂雙分子以及載脂蛋白表面的磷脂酰膽堿,在磷脂酶A1的作用下磷脂酰膽堿甘油主鏈第一個碳原子的脂肪酸被水解生成2-酰基-溶血磷脂酰膽堿,而磷脂酶A2則水解甘油主鏈第二個碳原子生成1-�；�-溶血磷脂酰膽堿。心臟缺血再灌注損傷可以造成細胞膜上的磷脂酰膽堿的降解,激活的磷脂酶A2使得脂肪酸在細胞膜上的積累,不飽和脂肪酸花生四烯酸被認為可以促進再灌注階段的炎癥反應(yīng),而其他的脂肪酸具有緩解心臟缺血再灌注損傷的作用。另一方面,溶血磷脂酰膽堿可以引起心肌細胞鈣離子超載而影響大鼠心臟的機械與代謝活動,因此被認為與心律失常相關(guān)。許多刺激包括細胞內(nèi)外的氧化還原反應(yīng)都可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在心臟缺血再灌注損傷中心肌缺血區(qū)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78的表達顯著高于缺血邊緣區(qū)和邊緣遠區(qū)。過表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1信號通路下游分子XBP1后,GRP78明顯升高,心梗面積出現(xiàn)明顯下降,這說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路在保護心臟缺血再灌注損傷中起到重要作用。既往研究報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以增強磷脂酶iPLA2β的活性,并且在抑制iPLA2β的活性后可以顯著減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡的作用。因此,我們提出這一假設(shè):在心臟缺血再灌注損傷中溶血磷脂酰膽堿的升高一方面可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78的升高對心臟缺血再灌注損傷具有保護作用;另一方面溶血磷脂酰膽堿的升高可以引起鄰近內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng),可能是造成心臟缺血再灌注損傷無復(fù)流的一個重要因素。第一部分體外心肌缺血再灌注損傷中溶血磷脂酰膽堿表達以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化目的:觀察在缺血再灌注損傷中心肌的死亡以及細胞形態(tài)變化,同時檢測缺血再灌注損傷后細胞內(nèi)與細胞外溶血磷脂酰膽堿濃度的變化。觀察在缺血再灌注損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活情況,檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中重要分子伴侶GRP78以及GRP94的表達與分布。方法與結(jié)果:通過構(gòu)建體外心肌缺血再灌注模型模擬缺血再灌注損傷,從缺血時間和再灌注時間上控制變量,乳鼠心肌經(jīng)過3個小時的缺氧和過夜再灌注處理后,可以造成近40%的細胞死亡是常氧對照組細胞死亡的4倍(P0.001);而經(jīng)過6個小時缺氧與過夜再灌注處理的細胞可以造成78%的細胞死亡,與常氧對照組相比上升了近6倍(P0.001)。采用BD公司Calibur流式檢測經(jīng)缺氧6小時和再灌注過夜后的心肌細胞,與常氧組相比可以觀察到明顯的細胞形態(tài)的改變。通過溶血磷脂酰膽堿高效液相色譜法檢測試劑盒測定溶血磷脂酰膽堿,可以觀察到經(jīng)過缺氧后細胞內(nèi)溶血磷脂酰膽堿的濃度明顯上升,而細胞上清中溶血磷脂酰膽堿的濃度也顯著升高(P0.001)。除此之外,心肌缺血再灌注損傷可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路,分子伴侶GRP78與GRP94的表達上調(diào),并且分子伴侶GRP78在細胞膜上的分布也顯著增加。結(jié)論:體外心肌缺血再灌注損傷中可以誘導(dǎo)細胞內(nèi)外溶血磷脂酰膽堿表達并且激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路。第二部分溶血磷脂酰膽堿和分子伴侶GRP78對心臟缺血再灌注損傷的調(diào)控作用目的:為了明確溶血磷脂酰膽堿對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用,觀察外源性溶血磷脂酰膽堿對分子伴侶GRP78的表達的影響。為了明確GRP78對于心臟缺血再灌注損傷的作用,構(gòu)建心肌特異性過表達GRP78轉(zhuǎn)基因小鼠以及敲除GRP78的小鼠,觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78對于心臟缺血再灌注的保護作用以及具體的機制。方法與結(jié)果:實驗中分別給予乳鼠心肌細胞0～80μM溶血磷脂酰膽堿,12個小時后60μM～80μM的溶血磷脂酰膽堿明顯上調(diào)分子伴侶GRP78的表達。構(gòu)建αMHC-Cre和CAG-loxP-STOP-loxP-GRP78雙陽性的在心肌細胞中特異性過表達GRP78蛋白小鼠,并將單陽性或者野生型的小鼠作為實驗對照組。所有的小鼠都給予結(jié)扎前降支45分鐘,再灌注24小時的缺血再灌注處理。分離心臟組織并用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)進行染色,結(jié)果顯示與對照組相比在心肌細胞過表達GRP78可以降低缺血再灌注后的心梗面積(p0.05),降低心梗后纖維化的程度,并且過表達GRP78可以激活A(yù)kt信號通路。構(gòu)建αMHC-mER-Cre-mER和GRP78flox/flox小鼠,在小鼠第12周齡時給予腹腔注射他莫昔芬10mg/kg連續(xù)5天,剪切基因組中GRP78序列進而在心肌中特異性敲除GRP78蛋白。在注射他莫昔芬第十二天后敲除GRP78的小鼠縮短分數(shù)(FractionShortening,FS)明顯下降并引起小鼠死亡。結(jié)論:溶血磷脂酰膽堿可以上調(diào)乳鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78的表達,過表達GRP78的小鼠可以減少缺血再灌注后心梗面積和降低纖維化程度,這可能與Akt信號通路的激活有關(guān)。條件性誘導(dǎo)敲除GRP78以后小鼠心臟功能下降并引起小鼠死亡。第三部分外源性溶血磷脂酰膽堿對內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)的作用及機制的研究目的:觀察溶血磷脂酰膽堿誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞釋放炎癥因子白介素-8的情況,進一步檢測NF-κB以及類泛素化修飾在炎癥調(diào)控中的作用并且評估了內(nèi)皮細胞釋放白介素-8對單核細胞的粘附作用。方法和結(jié)果:溶血磷脂酰膽堿溶解在PBS中,分別給予內(nèi)皮細胞40、60和80μM溶血磷脂酰膽堿的濃度梯度。經(jīng)過3個小時的作用,內(nèi)皮細胞上清中白介素-8的釋放隨著溶血磷脂酰膽堿處理濃度的升高而升高,內(nèi)皮細胞核區(qū)域出現(xiàn)了 p65亞基的轉(zhuǎn)位。除此之外,經(jīng)過溶血磷脂酰膽堿處理后內(nèi)皮細胞-162IL-8啟動子序列熒光素酶的活性顯著上升(P0.001),而AP-1和NF-κB序列突變的熒光素酶的活性沒有顯著改變。另一方面,在敲低Ubc9和HDAC4后溶血磷脂酰膽堿對白介素-8的上調(diào)作用明顯減弱,在敲低Ubc9后溶血磷脂膽堿對于IκB蛋白降解作用明顯延遲。最后溶血磷脂酰膽堿可以顯著促進內(nèi)皮細胞與單核細胞THP-1的粘附作用,而使用白介素-8抗體后內(nèi)皮細胞與單核細胞的粘附作用顯著減輕。結(jié)論:溶血磷脂酰膽堿可以通過增加類泛素化作用激活NF-κB通路上調(diào)白介素-8的表達,進而促進內(nèi)皮細胞與單核細胞的粘附作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R541.4

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本文編號：2253060