【摘要】：背景：隨著現(xiàn)代生活方式的改變、生活節(jié)奏的加快和人口老齡化的日益嚴(yán)重,心臟疾病發(fā)病率的升高和發(fā)病的普遍性、年輕化將日益突出。心肌細(xì)胞凋亡并不是某一個(gè)獨(dú)立的心臟疾病,而是作為一個(gè)病理過程參與了多種心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展,缺血性心肌病、心律失常、先天性心臟病、心臟過負(fù)荷、心肌的病毒感染、心肌重塑及心力衰竭等疾病均與其有著密切的關(guān)系。然而,目前對(duì)心肌細(xì)胞凋亡尚缺乏足夠深入的理解,引起凋亡的多種因素、各因素間的相互作用以及下游信號(hào)通路的傳遞均有待進(jìn)一步深入研究。miRNA是非編碼RNA的一類,是由內(nèi)源基因編碼的單鏈RNA分子,長度約為18-24個(gè)核苷酸。目前的研究已經(jīng)表明這類小分子物質(zhì)在基因調(diào)控中起著廣泛的作用。對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡而言,闡明miRNA是如何通過某些途徑調(diào)控這一復(fù)雜過程是非常必要的,值得進(jìn)一步探索。本研究希望能研究某個(gè)miRNA在心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控中扮演的作用。 目的：本研究采用real time PCR的方法驗(yàn)證miR-214在心肌細(xì)胞接受氧化應(yīng)激后的表達(dá)情況。根據(jù)流式細(xì)胞技術(shù)及western Blot等實(shí)驗(yàn)方法表明miR-214在心肌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。并且通過生物信息學(xué)的方法,對(duì)miR-214的下游靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)合miR-214轉(zhuǎn)基因小鼠模型,進(jìn)一步研究miR-214調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。方法：1.分別以不同濃度和不同作用時(shí)間的過氧化氫刺激大鼠原代心肌細(xì)胞,模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞接受氧自由基氧化應(yīng)激的過程,采用real time PCR檢測miR-214的表達(dá)變化情況； 2.在心肌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-214后再予適當(dāng)濃度過氧化氫處理,與對(duì)照組相比,通過流式細(xì)胞術(shù)和western blot的方法分別檢測凋亡細(xì)胞數(shù)的比例以及相關(guān)蛋白表達(dá)情況； 3.使用在線預(yù)測軟件對(duì)miR-214進(jìn)行靶基因預(yù)測,然后利用real time PCR、 western Blot等方法驗(yàn)證靶基因mRNA以及蛋白表達(dá)量是否在miR-214過表達(dá)后發(fā)生相應(yīng)變化,并利用熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)對(duì)miR-214的靶序列進(jìn)行驗(yàn)證； 4.結(jié)合miR-214轉(zhuǎn)基因小鼠模型,利用real time PCR、western blot及免疫組化等方法再次從動(dòng)物水平驗(yàn)證miR-214下游靶基因并分析其調(diào)控凋亡過程的具體分子機(jī)制。 結(jié)果：1.不同濃度的過氧化氫同時(shí)作用心肌細(xì)胞6小時(shí),隨著濃度的提高,miR-214的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),心肌細(xì)胞經(jīng)過氧化氫應(yīng)激時(shí)miR-214表達(dá)量明顯低于正常心肌細(xì)胞。100uM終濃度的過氧化氫分別作用心肌細(xì)胞予不同的時(shí)間,選取Oh、1h、2h、4h、8h及12h為檢測點(diǎn),隨著氧化應(yīng)激作用時(shí)間的延長,miR-214的表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢。 2.體外轉(zhuǎn)染miR-214mimic至心肌細(xì)胞使miR-214過表達(dá),然后再分別予0uM(NC)和100uM濃度的過氧化氫處理誘導(dǎo)其凋亡。通過流式細(xì)胞技術(shù)和western blot實(shí)驗(yàn)表明,miR-214過表后的心肌細(xì)胞具有較低的細(xì)胞凋亡率,凋亡相關(guān)蛋白active-caspase3及cleaved PARP的表達(dá)也較對(duì)照組低。 3.應(yīng)用在線靶基因預(yù)測軟件,預(yù)測在大鼠原代心肌細(xì)胞內(nèi),bim、bak1、bax、 bnip3和casp7都有可能是miR-214的靶基因,進(jìn)一步通過real time PCR和western Blot實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-214后mRNA水平和蛋白水平均有下調(diào)的有bim、bax及casp7。接下來的熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)分析進(jìn)一步表明它們有可能是miR-214的直接作用靶點(diǎn),其3’-UTR中都存在與miR-214結(jié)合的作用位點(diǎn)。 4.通過構(gòu)建miR-214轉(zhuǎn)基因小鼠,利用real time PCR、western Blot及免疫組化等方法在體內(nèi)驗(yàn)證了pten、puma在mRNA和蛋白水平的表達(dá)較野生小鼠相比均有所下調(diào)。 結(jié)論：1.過氧化氫刺激心肌細(xì)胞,miR-214的表達(dá)量會(huì)隨著時(shí)間的增加或濃度的增大呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。 2.體外過表達(dá)miR-214mimic增強(qiáng)了心肌細(xì)胞的抗凋亡能力。 3.在影響凋亡的具體機(jī)制上,miR-214可能是同時(shí)通過多個(gè)下游靶點(diǎn)的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:BACKGROUND: With the change of modern life style, the acceleration of life rhythm and the increasing severity of aging population, the increasing incidence and prevalence of heart diseases will become increasingly prominent. Cardiomyocyte apoptosis is not an independent heart disease, but a pathological process involved in the occurrence of a variety of heart diseases. It is closely related to ischemic cardiomyopathy, arrhythmia, congenital heart disease, cardiac overload, myocardial viral infection, myocardial remodeling and heart failure. MicroRNAs are a class of non-coding RNAs, single-stranded RNA molecules encoded by endogenous genes and about 18-24 nucleotides in length. Recent studies have shown that these small molecules play an extensive role in gene regulation. For cardiomyocyte apoptosis, how microRNAs communicate is clarified. It is necessary to regulate this complex process through some pathways, and it is worth further exploring. We hope to study the role of a certain microRNA in the regulation of cardiomyocyte apoptosis.
AIM: To investigate the expression of microRNAs-214 in cardiomyocytes after oxidative stress by real-time PCR. The biological function of microRNAs-214 in cardiomyocytes was demonstrated by flow cytometry and Western Blot. The downstream target of microRNAs-214 was predicted and tested by bioinformatics method. Methods: 1. Rat primary myocardial cells were stimulated by hydrogen peroxide at different concentrations and at different time of action, and the process of oxygen free radical oxidative stress was simulated in vivo. The real-time PCR was used to detect microarray-214. The change of expression;
2. Mi-214 was overexpressed in cardiomyocytes and then treated with hydrogen peroxide at appropriate concentration. Compared with the control group, apoptotic cells were detected by flow cytometry and Western blot respectively.
3. Using on-line prediction software to predict the target gene of microRNA214, and then using real-time PCR, Western Blot and other methods to verify whether the target gene mRNA and protein expression changes after overexpression of microRNA214, and using luciferase double reporting system to verify the target sequence of microRNA214;
4. Combining with the transgenic mice model of microarray-214, the downstream target genes of microarray-214 were identified by real-time PCR, Western blot and immunohistochemistry, and the specific molecular mechanism of microarray-214 regulating apoptosis was analyzed.
Results: 1. Different concentrations of hydrogen peroxide at the same time on myocardial cells for 6 hours, with the increase of concentration, the expression of miR-214 showed a gradual downward trend. At the same time, the expression of Mi-214 decreased gradually with the prolongation of oxidative stress.
2. Mi-214 mimic was transfected into cardiomyocytes to overexpress Mi-214 in vitro, and then induced apoptosis by 0 uM (NC) and 100 uM hydrogen peroxide respectively. Flow cytometry and Western blot showed that the cardiomyocytes overexpressed by Mi-214 had a lower apoptosis rate, and the apoptosis-related proteins, active-caspase 3 and cleaved PARP, were found to be associated with apoptosis. The expression was also lower than that in the control group.
3. Using on-line target gene prediction software, it is predicted that bim, bak1, bax, BNIP 3 and CASP7 may be target genes of microarray-214 in rat primary myocardial cells. Further real-time PCR and Western Blot assay were used to detect the down-regulation of mRNA and protein levels of microarray-214 after overexpression of bim, Bax and casp7. The report system analysis further indicated that they may be direct targets of microRNAs-214, and there are binding sites with microRNAs-214 in their 3'-UTR.
4. The expression of PTEN and puma in the mRNA and protein levels of transgenic mice was down-regulated compared with wild mice by real-time PCR, Western Blot and immunohistochemistry.
Conclusion: 1. The expression of microarray-214 in cardiomyocytes stimulated by hydrogen peroxide decreased gradually with the increase of time or concentration.
2. overexpression of miR-214mimic enhances the anti apoptotic ability of cardiomyocytes.
3. Mi-214 may be synergistic with multiple downstream targets in the specific mechanism of apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.2

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本文編號(hào)：2244917