【摘要】：目的：通過建立細(xì)胞衰老模型來研究內(nèi)皮細(xì)胞在長期培養(yǎng)過程中細(xì)胞增殖能力的變化方式以及microRNA-138表達(dá)水平的變化方式,并探討microRNA-138在這一過程中作用。方法：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)連續(xù)4周每周以1：3的方式進(jìn)行傳代培養(yǎng),并將1-4周中每一周的細(xì)胞命名為P1、P2、P3和P4。每一代的細(xì)胞在固定的時(shí)間點(diǎn)(0、24、48和72 h))檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)每一代細(xì)胞microRNA-138的表達(dá)量。通過β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)microRNA-138對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞衰老程度的影響。通過CFSE實(shí)驗(yàn)以及PI實(shí)驗(yàn)檢測(cè)microRNA-138對(duì)內(nèi)細(xì)胞增殖能力的影響并研究具體的影響機(jī)制。結(jié)果：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸下降。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)microRNA-138在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),其含量隨著內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增加,在P1代細(xì)胞中的表達(dá)量最低而在P4代細(xì)胞中的表達(dá)量最高。在細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)中可以看到microRNA-138可以顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞衰老。MicroRNA-138可以明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。MicroRNA-138可以將G2/M期的細(xì)胞從29%降到11.84%,將G1/G0期的細(xì)胞從55.99%上升到75.83%。結(jié)論：在長期培養(yǎng)的過程中,內(nèi)皮細(xì)胞逐漸衰老,增殖能力逐漸下降,與此同時(shí),microRNA-138的表達(dá)水平逐漸上升。MicroRNA-138可以促進(jìn)細(xì)胞衰老并通過改變細(xì)胞周期的方式抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。目的：之前的研究證實(shí)microRNA-138能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。本研究通過各種體內(nèi)、體外功能實(shí)驗(yàn)探討microRNA-138對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞成血管功能的影響。方法：通過遷移實(shí)驗(yàn)、成血管實(shí)驗(yàn)、成球?qū)嶒?yàn)研究等體外實(shí)驗(yàn)研究microRNA-138對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞成血管能力的影響。通過基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)以及視網(wǎng)膜成血管實(shí)驗(yàn)等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究microRNA-138能否對(duì)體內(nèi)的成血管過程產(chǎn)生影響。結(jié)果：在體外實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)microRNA-138能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞額遷移能力,減少管腔樣結(jié)構(gòu)在基質(zhì)膠上形成并能夠抑制三維內(nèi)皮細(xì)胞球的芽生能力。在基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)中,我們看到microRNA-138能夠抑制能夠拮抗VEGF的誘導(dǎo)成血管作用。在視網(wǎng)膜成血管實(shí)驗(yàn)中,microRNA-138能夠抑制新生小鼠的視網(wǎng)膜內(nèi)出生后的血管生成。結(jié)論：在體內(nèi)和體外的成管功能實(shí)驗(yàn)中,microRNA-138能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力。目的：之前的研究證實(shí),microRNA-138能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力,但具體的機(jī)制并不明了,本部分研究探討microRNA-138調(diào)控血管生成的具體機(jī)制。方法：通過生物信息學(xué)算法尋找microRNA-138的下游靶基因,通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)探討microRNA-138對(duì)下游靶基因的調(diào)控方式,通過WB實(shí)驗(yàn)以及PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在內(nèi)皮細(xì)胞中microRNA-138是否能對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控。通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證microRNA-138調(diào)控血管生成的過程是通過下游靶基因完成的。結(jié)果：SIRT1是microRNA-138的下游靶基因,該基因的nRNA3'UTR區(qū)與microRNA-138互補(bǔ)配對(duì),雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)microRNA-138可以通過SIRT1 mRNA3’UTR調(diào)控SIRT1的表達(dá)。在內(nèi)皮細(xì)胞中,過表達(dá)microRNA-138能夠下調(diào)SIRT1mRNA水平以及蛋白水平。過表達(dá)SIRT1能夠逆轉(zhuǎn)microRNA-138對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞成血管能力的抑制作用結(jié)論：MicroRNA-138通過下調(diào)SIRT1的表達(dá)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力
[Abstract]:AIM: To study the changes of cell proliferation and microRNA-138 expression during long-term culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), and to explore the role of microRNA-138 in this process. Cells were cultured for 1-4 weeks and named P1, P2, P3 and P4. Cell proliferation was measured at fixed time points (0, 24, 48 and 72 h). The expression of microRNA-138 was detected by RT-PCR. The effect of microRNA-138 on endothelial cell senescence was detected by beta-galactosidase staining. The effects of microRNA-138 on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells were investigated by CFSE and PI assays. Results: The proliferation ability of human umbilical vein endothelial cells decreased with the prolongation of culture time. MicroRNA-138 can significantly promote endothelial cell senescence. MicroRNA-138 can significantly inhibit the proliferation of human umbilical vein endothelial cells. MicroRNA-138 can inhibit the G2/M phase. CONCLUSION: Endothelial cells gradually senesce and proliferative capacity gradually decrease during long-term culture, while the expression of microRNA-138 gradually increases. MicroRNA-138 can promote cell senescence and inhibit endothelial fineness by changing cell cycle. Objective: Previous studies have confirmed that microRNA-138 can inhibit the proliferation of vascular endothelial cells. In this study, we investigated the effects of microRNA-138 on vascular endothelial cells in vitro and in vivo. Methods: Migration experiments, angiogenesis experiments, globulation experiments and other in vitro experiments were used to study microRNA-13. The effect of microRNA-138 on vascular endothelial cells was studied by matrix gel plug test and retinal angiogenesis test in vivo. Results: In vitro experiments, we found that microRNA-138 could inhibit the frontal migration of endothelial cells and reduce the lumen-like structure in the base. MicroRNA-138 can inhibit angiogenesis in vivo and in vivo. Conclusion: In vivo and in vivo, microRNA-138 can inhibit angiogenesis in neonatal mice. Objective: Previous studies have confirmed that microRNA-138 can inhibit the angiogenesis of endothelial cells, but the specific mechanism is not clear. This part studies the specific mechanism of microRNA-138 in regulating angiogenesis. Informatics algorithm searches for the downstream target gene of microRNA-138. The regulation of microRNA-138 on the downstream target gene was studied by double luciferase assay. Whether microRNA-138 can regulate the target gene in endothelial cells was detected by WB assay and PCR assay. Results: SIRT1 was the downstream target gene of microRNA-138. The nRNA3'UTR region of SIRT1 was complementary to microRNA-138. Double luciferase assay confirmed that microRNA-138 could regulate SIRT1 expression through SIRT1 mRNA 3'UTR. Overexpression of microRNA-138 could down-regulate SIRT1 mRNA level and protein water in endothelial cells. Ping. Overexpression of SIRT1 can reverse the inhibitory effect of microRNA-138 on the angiogenesis of endothelial cells. Conclusion: MicroRNA-138 regulates the angiogenesis of endothelial cells by down-regulating the expression of SIRT1.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543

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本文編號(hào)：2199464