發(fā)布時間：2018-07-03 16:45

  本文選題：β_2GPI蛋白 + 基因多態(tài)性��； 參考：《華中科技大學》2015年博士論文

【摘要】：血栓栓塞性疾病是一種嚴重危害人類健康的常見疾病,包括靜脈血栓栓塞性疾病(深靜脈血栓形成、肺栓塞)和動脈血栓栓塞性疾病(心肌缺血、缺血性腦梗塞)。血栓形成及其并發(fā)癥已成為世界范圍內致殘率和致死率最高的疾病之一。血栓栓塞性疾病是一種多因素性疾病,遺傳性易栓背景及獲得性易栓因素均在其發(fā)病中發(fā)揮著不可或缺的作用。盡管目前已有很多基因變異導致的凝血或抗凝蛋白功能失調被認為與血栓形成具有關聯(lián),但仍有許多血栓患者的遺傳背景不能被目前已知的遺傳性易栓背景所解釋,故而探索新的可能與血栓形成相關的基因變異顯得尤為重要。近來有研究表明,β2GPI是體內一種天然的抗凝蛋白,主要通過抑制凝血酶的凝血活性但不影響凝血酶對蛋白C的激活而發(fā)揮抗凝作用。 目的：β2GPI編碼基因為APOH,本研究以APOH基因作為候選基因,研究其多態(tài)性是否與為中國人群血栓栓塞性疾病的危險因素；并進一步探索APOH基因多態(tài)性導致β2GPI下降及血栓形成的具體機制。 方法：選擇26例狼瘡抗凝物質陽性的患者,通過對其APOH基因的8個外顯子及其剪接位點、3端及5端非翻譯區(qū)進行PCR后直接測序的方法查找基因變異；隨機挑選60例靜脈血栓患者,缺血性腦梗塞患者及正常對照組DNA進行測序驗證第一步所發(fā)現(xiàn)的基因變異,并大致評估其對疾病形成的風險；用Haploview4.0軟件行基因變異的連鎖不平衡分析；進一步擴大樣本量行病例對照研究(1304例VTE vs1334例正常組；1444例IS vs1334例正常組)評估基因變異對血栓形成的風險比；挑選各類型血漿行Mestern blot及ELISA行β2GPI抗原水平檢測及凝血功能試驗(凝血酶原時間及凝血酶生成實驗)；體外重組野生型及突變型APOH表達質粒行細胞實驗,檢測基因變異對p2GPI的表達及凝血功能的影響。結果：在26例狼瘡抗凝物陽性的患者中主要發(fā)現(xiàn)了四個基因多態(tài)性,c.1004GC、 c.461GA.c4221C、c.-32CA,結果顯示這4種APOH基因多態(tài)性完全連鎖不平衡(D’=1,r2=1),選用c.461GA作為限制性內切酶酶切代表,形成三種單倍型H1(CTGG/CTGG),H2(CTGG/ACAC)及H3(ACAC/ACAC).酶切結果顯示H2,H3單倍型對靜脈血栓形成的優(yōu)勢比為1.5和7,而其對動脈血栓形成作用不大。血漿實驗發(fā)現(xiàn),H2,H3單倍型血漿β2GPI蛋白減少,凝血酶原時間縮短,凝血酶生成增多。 細胞實驗證實c.-32CA造成APOH基因的表達水平下降,導致細胞內外β2GPI蛋白均減少。含p.Trp335Ser、p.Arg154His、p.Ile141Thr的突變蛋白使血漿凝血酶原時間縮短,凝血酶生成能力增強;當血漿β2GPI蛋白濃度降低時也呈現(xiàn)出相同的作用。 結論：APOH基因突變造成的β2GPI蛋白質和量的下降均有利于血栓形成,可將其作為血栓性疾病的候選基因,可用于由常規(guī)凝血及抗凝蛋白遺傳背景不能解釋的血栓患者的遺傳背景分析。
[Abstract]:Thromboembolic disease is a common disease that seriously endangers human health, including venous thromboembolism (deep venous thrombosis, pulmonary embolism) and arterial thromboembolic disease (myocardial ischemia, ischemic cerebral infarction). Thrombosis and its complications have become one of the diseases with the highest morbidity and mortality in the world. Thromboembolic disease is a multifactor disease. Hereditary tethered background and acquired thrombolytic factors play an indispensable role in its pathogenesis. Although many genetic mutations have been associated with coagulation or anticoagulant protein dysfunction, it is considered to be associated with thrombus formation, but there are still many genetic backgrounds of patients with thrombus. It is not possible to be explained by the known genetic prone background of thrombus, so it is particularly important to explore new gene mutations that may be associated with thrombosis. Recently, studies have shown that beta 2GPI is a natural anticoagulant in the body, mainly by inhibiting thrombin activity but not affecting the activation of thrombin on protein C. Use.
Objective: the gene of beta 2GPI is APOH. This study uses APOH gene as a candidate gene to study whether the polymorphism is associated with the risk factors of thromboembolic disease in Chinese population, and to further explore the specific mechanism of APOH gene polymorphism leading to the decrease of beta 2GPI and thrombosis.
Methods: 26 patients with positive anticoagulant substance of lupus were selected to search for genetic variation by direct sequencing of 8 exons of APOH gene and their splice sites, 3 end and 5 end non translation regions, and 60 patients with venous thrombosis, ischemic cerebral infarction and normal control group DNA were randomly selected to verify the first step of sequencing. The genetic variation found and roughly assessed the risk of disease formation; linkage disequilibrium analysis of gene mutation with Haploview4.0 software; further enlargement of sample size in case control study (1304 cases of VTE vs1334 cases; 1444 cases of IS vs1334 normal group) to assess the risk ratio of gene mutation to thrombosis; select various types of genes Mestern blot and ELISA were used to detect the level of beta 2GPI antigen and blood coagulation test (prothrombin time and thrombin generation test); recombinant wild type and mutant APOH expression plasmid was used in vitro to detect the expression of p2GPI and the effect of coagulant function. Results: in 26 cases of lupus anticoagulant positive patients Four genetic polymorphisms, c.1004GC, c.461GA.c4221C, c.-32CA, were found. The results showed that the 4 APOH gene polymorphisms were completely unbalanced (D '=1, r2=1). C.461GA was selected as a restrictive endonuclease, and three haplotype H1 (CTGG/CTGG), H2 (CTGG/ACAC). The dominant ratio of vein thrombosis was 1.5 and 7, but it did not play a significant role in the formation of arterial thrombosis. Plasma experiments showed that H2, H3 haplotype plasma beta 2GPI protein decreased, prothrombin time shortened, and thrombin production increased.
Cell experiments confirmed that c.-32CA resulted in the decrease of the expression level of APOH gene and the decrease of beta 2GPI protein in and out of cells. The mutant protein containing p.Trp335Ser, p.Arg154His and p.Ile141Thr shortened the plasma prothrombin time and increased the ability of thrombin generation, and also showed the same effect when the concentration of plasma beta 2GPI protein decreased.
Conclusion: the decrease of protein and amount of beta 2GPI caused by APOH gene mutation is beneficial to thrombosis. It can be used as a candidate gene for thrombotic disease and can be used for genetic background analysis of patients with thrombus that can not be explained by conventional coagulation and anticoagulant genetic background.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543

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本文編號：2094291