發(fā)布時間：2018-06-24 02:30

  本文選題：高血壓病 + 心肌纖維化��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景高血壓性心臟病是高血壓病患者主要的心臟并發(fā)癥之一,與心律失常和冠狀動脈硬化性心臟病密切相關(guān),是心力衰竭的最常見病因之一。經(jīng)典的觀點認為因為血壓持續(xù)升高、機械刺激導(dǎo)致心室壓力超負荷引起代償性肥大,細胞水平表現(xiàn)為心肌細胞的肥大和細胞表型的改變,最終影響到心臟的收縮功能導(dǎo)致心力衰竭。流行病學調(diào)查顯示左室肥大是心力衰竭的獨立危險因素；但是,盡管抗高血壓治療策略及針對心肌保護的措施在持續(xù)更新,高血壓患者心力衰竭的發(fā)病率與其他主要的心血管事件一樣,仍然居高不下。而近來的基礎(chǔ)研究和臨床研究顯示,細胞外基質(zhì)的沉積和轉(zhuǎn)換異常是高血壓導(dǎo)致的靶器官損傷的病理生理學基本機制中的關(guān)鍵因素。高血壓引起的心室壓力超負荷會引起心肌成纖維細胞表型改變而轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,并在心臟中產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的過量累積最終導(dǎo)致心肌纖維化。高血壓病患者心肌活檢中證實有明顯而廣泛的心肌間質(zhì)膠原纖維沉積和各型膠原比例失調(diào)。而心肌纖維化會導(dǎo)致心室壁僵硬度增加,心室順應(yīng)性下降,病程早期即可以首先引起舒張功能障礙；而持續(xù)的壓力超負荷最終可能導(dǎo)致心室重塑由向心性肥厚轉(zhuǎn)向離心性肥厚,心室擴張,功能失代償從而導(dǎo)致舒張性和／或收縮性心力衰竭。因此,防治心肌纖維化對于控制高血壓性心臟損害的發(fā)展及改善疾病預(yù)后有著重要的意義。但是,臨床缺乏有效而安全的抗心肌纖維化的治療藥物,所以,尋找抗纖維化的有效治療靶點是基礎(chǔ)研究和臨床實踐亟需解決的問題。心臟是由多種細胞構(gòu)成的有機整體。有學者應(yīng)用熒光分選系統(tǒng)分析心臟細胞論文Ⅰ通心絡(luò)對高血壓病心肌纖維化的作用及機制研究(細胞實驗)類型顯示：心肌細胞占56%,心肌成纖維細胞占27%,心臟微血管內(nèi)皮細胞占7%,血管平滑肌細胞占10%；此外,還存在免疫細胞。不同細胞在心臟中承擔著不同的作用與功能,而且,越來越多的學者認為,心臟細胞通過直接的或間接的交流構(gòu)成的心臟(細胞)微環(huán)境,在各種心臟疾病病理生理機制的形成和發(fā)展中起到了重要作用；有專家認為成功的心臟修復(fù)和再生策略有賴于心臟微環(huán)境的精細定量調(diào)控。比如,應(yīng)用干細胞對心臟疾病的治療時,干細胞類生物制劑必須.卜心臟移植部位微環(huán)境進行競爭,甚至實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)病理環(huán)境,才能有效地改善心肌的微環(huán)境,以可以提高干細胞治療的效果。又比如在合適的細胞微環(huán)境中,心肌成纖維細胞可以重編程為心肌樣細胞而補充損失的心肌細胞。對于心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展而言,心臟細胞間相互作用和微環(huán)境的作用同樣重要。首先,不同的心臟細胞可以改變各自的生物學行為；其次,心臟細胞通過自分泌、旁分泌細胞因子的形式介導(dǎo)細胞間交流；第三,細胞間存在交互通話,如細胞—細胞或細胞—基質(zhì)通過粘附因子接觸、縫隙連接介導(dǎo)進行細胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)移等。所以,心臟細胞間的相互作用及其構(gòu)建的微環(huán)境,通過以上途徑,參與了心肌纖維化的進程；同時,這些機制給臨床治療帶來了新的啟示。目前,隨著對心臟非心肌細胞的認識深入,非心肌細胞的功能被認為是心臟病理生理機制的“集線器”。其中,心肌成纖維細胞和心臟微血管內(nèi)皮細胞的重要性得到了越來越多的關(guān)注。首先,心肌成纖維細胞是形成心肌纖維化的首要效應(yīng)細胞,其主要功能是負責合成細胞外基質(zhì)蛋白和維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。在心臟中,成纖維細胞發(fā)生表型變化而轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,在心臟中產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的過量累積是心肌纖維化的關(guān)鍵細胞事件,是高血壓性心臟病的早期事件,也代表著心臟纖維化導(dǎo)致病理性心臟重塑和功能障礙的關(guān)鍵事件。此外,心肌肌成纖維細胞的異源性提示心臟纖維化的形成可能是心臟微環(huán)境與不同類型細胞之間的交互作用異常而導(dǎo)致的。目前已知的心肌肌成纖維細胞的來源尚有爭議：心臟豐富的原位成纖維細胞被認為是肌成纖維細胞的主要來源；骨髓起源的循環(huán)纖維細胞和由心臟微血管內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化都被報道可以形成心肌肌成纖維細胞。因此,對于心肌纖維化的治療首要的和基本的措施是抑制心肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化和糾正心肌成纖維細胞的異常生物學行為和功能。其次,在血流動力學異常、機械應(yīng)力刺激、神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)機制紊亂和心臟微環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡等病理情況時,心臟微血管內(nèi)皮細胞是最早感受到病理性刺激并做出反應(yīng)的細胞,也是損傷最早的細胞。心臟微血管內(nèi)皮細胞損傷與活化可能是心臟疾病的最初表現(xiàn),血管生成功能障礙是最常見的血管損傷的表現(xiàn)。而在應(yīng)激或細胞因子活化的內(nèi)皮細胞與可以與成纖維細胞相互作用,與纖維生成反應(yīng)密切相關(guān)：合成與釋放炎癥因子(如TNFa和IL-6)；合成與釋放促纖維化生成的介質(zhì)(如CTGF和TGFβ1);異常的氧化還原狀態(tài)；內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化為成纖維細胞。因此,保護心臟微血管內(nèi)皮細胞功能,抑制內(nèi)皮細胞活化,調(diào)控微血管內(nèi)皮細胞和心肌成纖維細胞的異常生物學行為,維持心臟微環(huán)境穩(wěn)態(tài),同樣也是心肌纖維化的重要靶點。miRNA是生物內(nèi)源性的單鏈小分子RNA,并不編碼蛋白質(zhì),主要的作用機制是通過與靶基因的mRNA 3'端非翻譯區(qū)(3’UTR)按堿基互補配對的原則結(jié)合,從而促進靶基因mRNA降解或者抑制靶基因mRNA翻譯,從而在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控靶基因表達。miRNA可以直接調(diào)節(jié)細胞生物學行為,包括細胞的增殖、凋亡及分化等,廣泛參與生命進程及疾病的發(fā)生發(fā)展中；也可以借助細胞外來體(exosome)作為載體進行信息傳遞,參與調(diào)控細胞微環(huán)境. miRNA為我們認識心臟正常發(fā)育和疾病機制提供了新的思路。miR-133a誘導(dǎo)干細胞向心肌細胞的分化,調(diào)控心臟形態(tài)的發(fā)育；miR-133a可以表達在心肌細胞、心肌成纖維細胞和內(nèi)皮細胞,直接參與調(diào)控與心室重塑、心肌纖維化和血管生成直接相關(guān)的信號通路；在病理條件下miR-133a對心臟結(jié)構(gòu)和功能能夠發(fā)揮保護性作用。因此,調(diào)節(jié)miR-133a的表達,調(diào)控心臟細胞的生物學行為以及與之相關(guān)的信號通路,被認為是有效治療心肌纖維化的可能分子靶點。通心絡(luò)膠囊,是基于中醫(yī)絡(luò)病學說制定的通絡(luò)干預(yù)的代表方劑。近二十年以來,通心絡(luò)膠囊臨床廣泛運用于心腦血管疾病,包括心絞痛、動脈粥樣硬化、高血壓和腦梗塞等�；A(chǔ)研究顯示通心絡(luò)膠囊的藥理作用機制具有多效性,包括抗炎、抗氧化、抗纖維化等。因而,通心絡(luò)膠囊被認為是部分心血管疾病的替代性或補充性治療,甚至可作為基礎(chǔ)治療。從已發(fā)表的研究成果和文獻分析,微血管和血管內(nèi)皮細胞是通心絡(luò)作用的重要靶點。同時在基礎(chǔ)研究和動物實驗中的證據(jù)顯示,通心絡(luò)對于心臟纖維化和腎臟纖維化有抗纖維化作用；如我們前期的實驗顯示通心絡(luò)膠囊減輕了自發(fā)性高血壓大鼠的心臟重塑。但是,目前研究都缺乏對通心絡(luò)膠囊抗纖維化的作用機制研究。因為高血壓病導(dǎo)致心臟壓力超負荷會引起心臟局部和全身循環(huán)內(nèi)Ang II的水平升高；而Ang II是明確的心臟促纖維生成因子和促炎癥因子,可以通過TGFβ1/Smad3或IL-6/ERK途徑活化心肌成纖維細胞,并誘導(dǎo)膠原蛋白的表達,是引起高血壓病心肌纖維化發(fā)生和進展的重要因素。在本部分的研究中,我們使用了AngⅡ干預(yù)的原代心肌成纖維細胞和原代心臟微血管內(nèi)皮細胞體外模擬和觀察高血壓病心肌纖維化的病理狀態(tài)下的細胞生物反應(yīng)以及通心絡(luò)干預(yù)的影響；假設(shè)miR-133a可能是通心絡(luò)發(fā)揮抗心肌纖維化作用的重要靶點并在實驗中進行相應(yīng)的干預(yù)研究。研究目的：1.觀察通心絡(luò)對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化和功能異常的影響；2.觀察通心絡(luò)對Ang Ⅱ引起的心臟微血管內(nèi)皮細胞損傷和活化的影響,以及對心臟細胞微環(huán)境的調(diào)節(jié)；3.探討通心絡(luò)發(fā)揮作用的具體機制,以及與miR-133a的關(guān)系。研究方法1.原代心肌成纖維細胞和心臟微血管內(nèi)皮細胞分離、鑒定和培養(yǎng)利用酶消化法和差速分離技術(shù)自Wistar乳鼠(出生1-3天內(nèi))的心臟分離原代心肌成纖維細胞和心臟微血管內(nèi)皮細胞。分別利用成纖維特異性蛋白(FSP)-1抗體、乙酰化低密度脂蛋(DiI-ac-LDL)抗體和CD3 1抗體進行細胞免疫熒光染色以鑒定心肌成纖維細胞和心臟微血管內(nèi)皮細胞。取生長狀態(tài)良好的第2-3代細胞進行實驗。2.篩選通心絡(luò)溶液對細胞活性作用的合適濃度區(qū)間和時間采用CCK-8方法進行細胞活性檢測,以分別篩選通心絡(luò)溶液對心肌成纖維細胞和心臟微血管內(nèi)皮細胞作用的合適濃度區(qū)間和時間。3.心肌成纖維細胞的分組與干預(yù)(1)觀察通心絡(luò)對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的影響以及其篩選最佳作用濃度：分為空白對照組(control組)、陽性對照組(Ang Ⅱ組)、各實驗組(Ang Ⅱ+不同濃度通心絡(luò)溶液)。按分組僅給予培養(yǎng)基或給予培養(yǎng)基、通心絡(luò)溶液和／或AngⅡ 100 nM刺激24小時。提取蛋白,檢測a-SMA蛋白表達,觀察通心絡(luò)對心肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化的影響。(2)根據(jù)干預(yù)因素分組：分為空白對照組(control組)、陽性對照組(Ang Ⅱ組)、陰性對照組(negative control組,Ang Ⅱ+Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染+通心絡(luò))和實驗組(treat組,Ang II+miR-133a inhibitors轉(zhuǎn)染+通心絡(luò))。4.心臟微血管內(nèi)皮細胞的分組與干預(yù)(1)確定通心絡(luò)對Ang Ⅱ損傷的心臟微血管內(nèi)皮細胞的體外成管功能的影響以及其篩選最佳作用濃度：分為空白對照組(control組)、陽性對照組(Ang Ⅱ組)、各實驗組(Ang Ⅱ+不同濃度通心絡(luò)溶液)。按分組僅給予培養(yǎng)基或給予培養(yǎng)基、通心絡(luò)溶液和／或Ang Ⅱ100 nM刺激24小時。觀察通心絡(luò)對心臟微血管內(nèi)皮細胞的體外成管功能的影響。(2)根據(jù)干預(yù)因素分組：分為空白對照組(control組)、陽性對照組(Ang Ⅱ組)、陰性對照組(negative control組,Ang Ⅱ+Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染+通心絡(luò))和實驗組(treat組,Ang II+miR-133a inhibitors轉(zhuǎn)染+通心絡(luò))。5. miR-133a inhibitors的轉(zhuǎn)染方法使用Lipofectamine 2000將miR-133a inhibitors轉(zhuǎn)染入心肌成纖維細胞和心臟微血管內(nèi)皮細胞以實現(xiàn)miR-133a沉默,以scrambled siRNA作為陰性對照組。實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR測定miR-133a表達水平以檢測轉(zhuǎn)染效果。6.心肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化和功能檢測利用免疫蛋白印跡檢測a-SMA的表達觀察心肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化。利用Transwell小室觀察心肌成纖維細胞的遷移能力的變化。利用3H脯氨酸摻入實驗檢測心肌成纖維細胞膠原合成能力的變化。利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測心肌成纖維細胞培養(yǎng)基上清中Ⅰ型膠原(collagen I)、白介素-6分析心肌成纖維細胞分泌功能的變化。7.心臟微血管內(nèi)皮細胞功能損傷和活化的檢測利用基質(zhì)膠成管實驗觀察心臟微血管內(nèi)皮細胞體外成管功能。利用ELISA檢測細胞上清中白介素-6和結(jié)締組織生長因子分析心臟微血管內(nèi)皮細胞分泌功能的變化。利用硝酸還原酶法檢測心臟微血管內(nèi)皮細胞一氧化氮(nitric oxide, NO)的含量。8.實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(real-time quantitative RT-PCR)。使用Trizol提取各組細胞總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR檢測細胞中的mRNA表達水平。使用mirVanarTM miRNA提取試劑盒提取各組細胞的miRNAs,并進行逆轉(zhuǎn)錄,應(yīng)用熒光標記的miR-133a特異性探針,檢測細胞中miR-133a的表達水平。9.收集各組細胞提取蛋白,分別檢測a-SMA、Smad3、p-Smad3、CTGF、 caveolin-1、eNOS、p-eNOS蛋白表達水平的變化。10.統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析處理數(shù)據(jù),各種獨立實驗至少重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準誤表示。兩組比較采用t檢驗；組間比較使用單因素方差分析法。以P0.05被認為有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果1.通心絡(luò)抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化(1)通心絡(luò)作用于心肌成纖維細胞的適宜濃度范圍和時間的篩選濃度在400μg/mL以內(nèi)的通心絡(luò)溶液是實驗的適宜濃度范圍；24 h對細胞活力影響最小。(2)通心絡(luò)抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞的a-SMA蛋白的表達。與空白對照組比較,Ang Ⅱ顯著增加了心肌成纖維細胞a-SMA的表達水平而不同濃度的通心絡(luò)均顯著抑制了Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌成纖維細胞的a-SMA表達；通心絡(luò)在400μg/mL的濃度時產(chǎn)生了最大的抑制作用,該濃度作為心肌成纖維細胞后續(xù)實驗的適宜濃度。(3)通心絡(luò)抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞的功能活化。與空白對照組比較,AngⅡ顯著增加了心肌成纖維細胞3H-羥脯氨酸摻入量；通心絡(luò)顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞3H-羥脯氨酸摻入量。與空白對照組比較,AngⅡ顯著增加了心肌成纖維細胞Ⅰ型膠原和1L-6的分泌；通心絡(luò)顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的1型膠原和IL-6的分泌。與空白對照組比較,AngⅡ顯著增加了心肌成纖維細胞遷移能力；通心絡(luò)顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞遷移能力。(4)通心絡(luò)對AngⅡ作用下心肌成纖維細胞miR-133a的表達水平的影響與空白對照組比較,AngⅡ作用下,心肌成纖維細胞中miR-133a的表達水平顯著降低。不同濃度的通心絡(luò)均顯著改善miR-133a的表達；通心絡(luò)在400μg/mL的濃度時產(chǎn)生了最大的作用。(5)通心絡(luò)通過調(diào)節(jié)miR-133a表達抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化對于轉(zhuǎn)染miR-133a抑制物的心肌成纖維細胞,通心絡(luò)抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；而對于轉(zhuǎn)染scrambled siRNA的心肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化仍存在抑制作用。(6)通心絡(luò)通過調(diào)節(jié)miR-133a表達抑制了Ang II誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞Smad3/CTGF信號通路的活化與空白對照組比較,Ang II誘導(dǎo)心肌成纖維細胞的Smad3磷酸化水平明顯上調(diào)并且顯著增加了CTGF的表達。對于轉(zhuǎn)染miR-133a抑制物的心肌成纖維細胞,通心絡(luò)沒有抑制AngⅡ誘導(dǎo)上調(diào)的Smad3磷酸化水平和CTGF的表達水平,而對于轉(zhuǎn)染scrambled siRNA的CFs仍存在抑制作用。2.通心絡(luò)改善了AngⅡ誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細胞的損傷和活化(1)通心絡(luò)作用于心臟微血管內(nèi)皮細胞的適宜濃度范圍和時間的篩選使用濃度在400μg/mL以內(nèi)的通心絡(luò)溶液是實驗的適宜濃度范圍。同時,結(jié)果顯示400μg/mL的通心絡(luò)在24h內(nèi)對細胞活性無顯著影響。(2)通心絡(luò)改善了AngⅡ損傷的心臟微血管內(nèi)皮細胞的體外成管功能與空白對照組比較,AngⅡ顯著抑制了心臟微血管內(nèi)皮細胞的體外成管功能。不同濃度的通心絡(luò)均顯著改善了心臟微血管內(nèi)皮細胞的成管功能；通心絡(luò)在400μg/mL的濃度時產(chǎn)生了最大的作用。(3)通心絡(luò)對AngⅡ作用下的心臟微血管內(nèi)皮細胞NO含量以及CTGF和IL-6分泌的影響空白對照組比較,AngⅡ顯著減少心臟微血管內(nèi)皮細胞的NO含量并增加了CTGF和IL-6分泌量；而通心絡(luò)干預(yù)顯著增加了NO含量并減少了CTGF和IL-6分泌量。(4)通心絡(luò)對AngⅡ作用下心臟微血管內(nèi)皮細胞miR-133a的表達水平的影響Ang Ⅱ作用下,心臟微血管內(nèi)皮細胞中miR-133a的表達水平顯著降低。不同濃度的通心絡(luò)均顯著恢復(fù)miR-133a的表達水平；通心絡(luò)在400μg/mL的濃度時產(chǎn)生了最大的作用。(5)通心絡(luò)通過調(diào)節(jié)miR-133a表達而改善了AngⅡ損傷的心臟微血管內(nèi)皮細胞體外成管功能對于轉(zhuǎn)染miR-133a抑制劑的心臟微血管內(nèi)皮細胞,通心絡(luò)未能改善Ang Ⅱ損傷的成管功能；而對轉(zhuǎn)染scrambled siRNA的心臟微血管內(nèi)皮細胞成管功能,通心絡(luò)仍存在改善作用。(6)通心絡(luò)通過調(diào)節(jié)miR-133a抑制了AngⅡ誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細胞的小窩蛋白(caveolin, cav)-1的表達并促進了eNOS的活化與空白對照組比較,AngⅡ誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細胞cav-1的表達上調(diào)并降低了eNOS磷酸化水平。對轉(zhuǎn)染miR-133a抑制劑的心臟微血管內(nèi)皮細胞,通心絡(luò)失去了對eNOS磷酸化水平和cav-1表達的調(diào)節(jié)作用；而對轉(zhuǎn)染scrambled siRNA的心臟微血管內(nèi)皮仍存在調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)論1.通心絡(luò)抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化和功能活化,其作用與促進miR-133a表達、抑制促纖維生成相關(guān)的信號通路Smad3/CTGF有關(guān)；2.通心絡(luò)保護了Ang Ⅱ損傷的心臟微血管內(nèi)皮細胞的功能狀態(tài),其作用與促進miR-133a表達、抑制caveolin-1表達、活化血管內(nèi)皮保護相關(guān)的信號通路eNOS/NO有關(guān)；3.通心絡(luò)抑制了心臟微血管內(nèi)皮細胞的活化,改善了其異常代謝與分泌功能,從而調(diào)節(jié)了促心肌成纖維細胞活化和促纖維形成的細胞微環(huán)境。研究背景高血壓性心臟病是高血壓病患者主要的心臟并發(fā)癥之一；而心肌肥大一直被認為是高血壓心臟病最重要的病理變化,是導(dǎo)致心力衰竭的獨立危險因素。盡管抗高血壓治療策略及針對心肌保護的措施在持續(xù)更新,高血壓患者心力衰竭的發(fā)病率與其他主要的心血管事件一樣,仍然居高不下。近年來,基礎(chǔ)與臨床研究顯示心臟細胞外基質(zhì)的過量沉積和轉(zhuǎn)換異常導(dǎo)致的心肌纖維化,可能是高血壓病導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的病理生理學基本機制中的關(guān)鍵因素。高血壓病患者心肌活檢中證實有明顯而廣泛的心肌間質(zhì)膠原纖維沉積和各型膠原比例失調(diào)。高血壓或主動脈硬化出現(xiàn)的心臟壓力超負荷可以引起心肌纖維化,從而導(dǎo)致心室壁僵硬度增加,心室順應(yīng)性下降,病程早期即可以首先出現(xiàn)舒張功能障礙；而持續(xù)的壓力超負荷最終可能導(dǎo)致心室重塑由向心性肥厚轉(zhuǎn)向離心性肥厚,心室擴張,功能失代償從而導(dǎo)致舒張性和／或收縮性心力衰竭。因此,防治心肌纖維化對于控制高血壓性心臟結(jié)構(gòu)和功能損害的進展及改善疾病預(yù)后起了重要作用。近年來,心臟微血管和微血管內(nèi)皮細胞對心肌纖維化的重要作用開始引起了人們的關(guān)注。組織病理學顯示,心臟纖維化反應(yīng)與微血管生成的反應(yīng)的頻繁共存,而心臟壓力超負荷的情況下往往發(fā)生明顯的血管周圍纖維化；這些變化也提示了心肌纖維化往往涉及到心臟微血管的改變。微血管生成是心臟應(yīng)對應(yīng)激的代償性機制。病理刺激如高血壓帶來的異常血流動力學變化、缺血和缺氧、慢性神經(jīng)-論文Ⅱ通心絡(luò)對高血壓病心肌纖維化的作用及機制研究(動物實驗)體液的高反應(yīng)性能調(diào)節(jié)心臟內(nèi)微血管的生長,以適應(yīng)肥大的心臟對氧氣和營養(yǎng)日益增加的需求。在高血壓病動物模型中,病程早期對于心臟微血管生成的描述存在分歧,比如,有人觀察到SHR心臟微血管密度的增加,尤其是在生長的早期；但是更多的實驗提示,成年自發(fā)性高血壓大鼠的心、腦、腎等器官往往存在的微血管稀疏的情況。在病程中后期發(fā)生明顯心肌纖維化或發(fā)生顯著的心功能改變的時候,血管生成代償性的增強對病理刺激的反應(yīng)往往是不充分的。因此,對于肥大的心肌細胞增加的氧及能量的需求而言,微血管生成數(shù)量是相對不充足的；在血管網(wǎng)絡(luò)的改造過程中還存在微血管的破壞或退化,所以微血管的結(jié)構(gòu)和功能并不完善。同時,損傷還引起微血管內(nèi)皮活化,代謝異常以及旁分泌和內(nèi)分泌功能活躍,導(dǎo)致心臟炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),形成促纖維生成的心臟微環(huán)境。病理性微血管的生成并沒有明顯改善心臟的供血與供氧,其結(jié)局是進一步加重心臟代償性的功能和結(jié)構(gòu)重塑而向心衰轉(zhuǎn)化。有人推測血管生成功能障礙導(dǎo)致的微血管稀疏可能是高血壓病的重要特征之一,并且可作為預(yù)測心功能失代償?shù)闹匾笜�。因�?改善心臟微血管生成和糾正微環(huán)境紊亂,對于減輕心肌纖維化與保護心功能有重要意義。miRNA是生物內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA,主要通過與靶基因的mRNA3'端非翻譯區(qū)(3’UTR)按堿基互補配對的原則結(jié)合,促進靶基因mRNA降解或者抑制靶基因mRNA翻譯,從而在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控靶基因表達。microRNA-133a是心臟的表達較為豐富的miRNA,可以表達在心臟的多種細胞中,如心肌細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等。miR-133a廣泛地參與了心臟發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展。在胚胎發(fā)育階段miR-133a誘導(dǎo)干細胞向心肌細胞的分化并調(diào)控心臟形態(tài)的發(fā)育；miR-133a基因敲除小鼠的心臟存在室間隔缺損、室壁變薄、心室擴張、心功能減退等表現(xiàn),同時還可見廣泛的纖維化。在多種心肌重構(gòu)動物病理模型中,如經(jīng)主動脈縮窄術(shù)引起心室壓力超負荷的動物模型、自發(fā)性高血壓大鼠、AngⅡ持續(xù)給藥造模或腎素-2轉(zhuǎn)基因的高血壓大鼠,表現(xiàn)出心室肥厚、心肌纖維化和心力衰竭以及伴隨減少的心臟miRNA-133a表達。在人類發(fā)生病理性重構(gòu)的心室中也出現(xiàn)了miRNA-133a的表達下調(diào)。在動物模型中應(yīng)用miR-133a過表達可以阻止心肌纖維化的進展。因此,調(diào)節(jié)miR-133a及其下游靶基因相關(guān)的信號分子的表達,對于高血壓病心肌纖維化的治療有良好的應(yīng)用前景。高血壓病心肌纖維化是高血壓病緩慢進展的病程中出現(xiàn)的心臟并發(fā)癥；是心絡(luò)病變由氣到血,并在絡(luò)脈病變的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的臟器實質(zhì)性病變符合中醫(yī)“久病入絡(luò)”與“久瘀入絡(luò)“觀點。它是由于致病因素引起了心絡(luò)主持營衛(wèi)氣血交互生化的功能障礙,導(dǎo)致心絡(luò)氣血壅滯,體用俱損,與繼發(fā)性產(chǎn)生的痰濁瘀毒相互影響,絡(luò)息成積,致使心臟發(fā)生病理改變。所以,通絡(luò)干預(yù),恢復(fù)“絡(luò)以通為用”,是切合高血壓病心肌纖維化病機的治法。通心絡(luò)膠囊,是基于中醫(yī)絡(luò)病學說制定的通絡(luò)干預(yù)的代表方劑。近二十年以來,通心絡(luò)膠囊臨床廣泛運用于心腦血管疾病,包括心絞痛、動脈粥樣硬化、高血壓和腦梗塞等。近來,來自基礎(chǔ)研究和動物實驗中的證據(jù)顯示,通心絡(luò)對于心臟纖維化和腎臟纖維化有抗纖維化作用；我們前期的實驗顯示通心絡(luò)膠囊減輕了自發(fā)性高血壓大鼠的心臟重塑。但是都缺乏對通心絡(luò)膠囊抗纖維化的作用機制研究。在上一部分實驗中,我們證實通心絡(luò)在體外抑制了心肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化和功能活化、保護了心臟微血管內(nèi)皮細胞的功能并改善了細胞微環(huán)境,其作用通過調(diào)節(jié)miR-133a表達及相關(guān)信號通路有關(guān),可能是其體內(nèi)抗心肌纖維化的重要機制。為了證實這個假設(shè),我們使用自發(fā)性高血壓大鼠作為模型,觀察了通心絡(luò)在體內(nèi)對心肌纖維化的影響及其作用機制。研究目的：1.觀察通心絡(luò)對自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化和與促纖維生成的心臟微環(huán)境(微血管生成和炎癥反應(yīng))的影響；2.探討通心絡(luò)在自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)作用機制,及與miR-133a的關(guān)系。研究方法1.實驗動物的分組將40只8周齡雄性SHR隨機分為通心絡(luò)不同劑量治療組即高劑量治療組、中劑量治療組和低劑量治療組,以及陽性對照組,每組各10只。10只8周齡雄性Wistar大鼠作為正常對照組。2.血壓和心功能的測量采用無創(chuàng)血壓計測量大鼠尾動脈壓；采用二維、M超、組織多普勒和脈沖多普勒超聲成像技術(shù)評價大鼠左室舒張和收縮功能。3.組織病理學分析將大鼠心臟標本制備為石蠟切片,進行心肌膠原的Masson染色,并計算膠原膠原容積分數(shù)。應(yīng)用免疫組織化學染色,觀察心臟組織CD31的表達并計算心臟微血管密度。4.實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR收集各組別的組織并提取miR-133a,進行逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR,檢測組織中miR-133a表達水平。5.蛋白印跡收集各組別的細胞及組織并提取蛋白,分別檢測Ⅰ型膠原、Smad3、p-Smad3. CTGF、eNOS、p-eNOS和VEGF-A等蛋白的表達水平。6.NO含量以及IL-6和TNFα的測定利用ELISA檢測心臟組織IL-6和TNFα。利用硝酸還原酶法心臟組織NO的含量。7.統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以并以均數(shù)士標準誤表示。兩組比較采用t檢驗；組間比較使用單因素方差分析法。以P0.05被認為有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果1.通心絡(luò)降低了SHR的收縮壓SHR組及通心絡(luò)不同劑量組血壓顯著高于WKY組；與SHR比較,通心絡(luò)治療顯著抑制了SHR血壓升高的趨勢。各不同劑量治療組間沒有顯著性差異。2.通心絡(luò)改善了SHR心臟舒張功能SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的左室舒張功能E/A值、左室壁動度E'/A'值顯著低于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的E/A值、E'/A'值顯著升高。但各劑量組間并沒有顯著差異。與WKY組比較,SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的EF及FS值無顯著差異。3.通心絡(luò)減輕了SHR心肌纖維化程度SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的膠原容積分數(shù)明顯高于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的CVR顯著降低；但各劑量組間并沒有顯著差異。SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的Coll的表達明顯高于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的ColⅠ的表達顯著降低；但各劑量組間并沒有顯著差異。SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的a-SMA的表達明顯高于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的a-SMA的表達顯著降低(p0.05)；但各劑量組間并沒有顯著差異。4.通心絡(luò)增加了SHR心臟微血管密度SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的MVD明顯低于于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的MVD顯著升高；但各劑量組間并沒有顯著差異。5.通心絡(luò)增加了SHR心臟的NO含量SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的心臟NO含量明顯低于于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的心臟NO含量顯著升高；但各劑量組間并沒有顯著差異。6.通心絡(luò)減少了SHR心臟炎癥因子IL-6和TNFa的表達SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的IL-6和TNFa表達明顯低于于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的IL-6和TNFa表達顯著升高；但各劑量組間并沒有顯著差異。7.通心絡(luò)增加了SHR心臟miR-133a表達SHR組及通心絡(luò)不同劑量組的miR-133a表達水平明顯低于于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的miR-133a顯著升高；但各劑量組間并沒有顯著差異。8.通心絡(luò)降低了SHR心臟Smad3的磷酸化水平和CTGF的表達SHR組及通心絡(luò)不同劑量組Smad3的磷酸化水平和CTGF的表達顯著高于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的心臟Smad3的磷酸化水平和CTGF的表達顯著降低：但各劑量組間并沒有顯著差異。9.通心絡(luò)減少了SHR心臟caveolin-1的表達并增加了eNOS的磷酸化水平SHR組及通心絡(luò)不同劑量組心臟的caveolin-1表達水平明顯高于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組的caveolin-1表達水平的表達顯著降低；但各劑量組間并沒有顯著差異。SHR組及通心絡(luò)不同劑量組心臟的eNOS磷酸化水平明顯低于于WKY組。與SHR組比較,通心絡(luò)不同劑量組)的eNOS磷酸化水平的表達顯著升高；但各劑量組間并沒有顯著差異。研究結(jié)論1.通心絡(luò)可以改善高血壓病心肌纖維化,以及通過增加心臟微血管密度和減輕心臟炎癥水平,糾正了促纖維生成的心臟微環(huán)境改變,從而較好的改善了心臟的功能和結(jié)構(gòu)重塑；2.在體外實驗的基礎(chǔ)上,動物實驗證實了通心絡(luò)可以調(diào)節(jié)SHR心臟miR-133a的表達水平,并影響miR-133a調(diào)控的下游靶基因相關(guān)的促纖維化和促血管生成相關(guān)的信號通路；3.以通心絡(luò)為代表的通絡(luò)干預(yù)適用于心肌纖維化的治療。論文Ⅲ通心絡(luò)對高血壓病腎損害的作用及機制研究研究背景高血壓病是嚴重危害人類健康的常見病,其引起的心腦血管及腎等重要臟器損傷導(dǎo)致的并發(fā)癥致殘及致死率高,已成為全球范圍的重要公共衛(wèi)生議題。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn),我國高血壓病患病率有上升趨勢。因為腎臟不僅是高血壓影響的重要靶器官,也是血壓調(diào)節(jié)的重要器官,未經(jīng)控制的高血壓病患者發(fā)生腎功能不全的比例約為18%；據(jù)美國腎臟數(shù)據(jù)系統(tǒng)統(tǒng)計,高血壓病是引起終末期腎病的比例高達30%。因此,高血壓腎損害被視為終末期腎病并導(dǎo)致透析需求的重要病因。治療頗為棘手,研究行之有效的治療策略是臨床上亟需解決的問題。與高血壓病相關(guān)的。腎損害的涉及腎小球和腎間質(zhì)的損傷,最終會導(dǎo)致腎功能障礙甚至腎功能衰竭。在高血壓病程中持續(xù)升高的血壓水平導(dǎo)致腎臟血流動力學紊亂和局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的活化,具有促氧化和促炎的作用,被認為是腎臟損害的啟動因素。氧化應(yīng)激在于高血壓病相關(guān)的腎臟損害的進展中起著關(guān)鍵性作用。氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧幾乎影響了腎臟所有的固有細胞和浸潤細胞導(dǎo)致腎臟微環(huán)境改變。首先,在高血壓性腎損害中,腎小球內(nèi)皮細胞作為濾過膜的第一層屏障,是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的首當其沖的受害者。其次,氧化應(yīng)激可以促進足細胞凋亡和節(jié)段性腎小球硬化的發(fā)生,導(dǎo)致腎臟濾過功能障礙。第三,氧化應(yīng)激通過促進腎臟中近端小管和系膜細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進了肌成纖維細胞的在腎臟的積累,導(dǎo)致腎間質(zhì)細胞外基質(zhì)的重塑。第四,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可以引起炎癥細胞的趨化和浸潤,進一步加重高血壓病腎損害。因而抗氧化治療是高血壓性腎損害重要的治療策略。在氧化應(yīng)激激活的各種信號通路中,叉頭蛋白(Forkbox, Fox)01核轉(zhuǎn)錄因子在保護細胞中對抗氧化應(yīng)激損傷中起到了重要的作用。在正�；虿±頎顟B(tài)下,FoxO1主要是調(diào)節(jié)了特異性的抗氧化酶類的表達以保護組織細胞免于氧化損傷。FoxO1也可以抑制系膜細胞的EMT和ECM的分泌。多種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制可以直接調(diào)控FoxO1蛋白的功能,也可以通過調(diào)節(jié)腎臟炎癥和纖維化信號發(fā)揮腎臟保護作用。高血壓病腎損傷是高血壓病緩慢進展的病程中出現(xiàn)的腎臟并發(fā)癥,符合中醫(yī)“久病入絡(luò)”觀點。它是由于致病因素引起了腎絡(luò)主持營衛(wèi)氣血交互生化的功能障礙,導(dǎo)致腎絡(luò)氣血壅滯,體用俱損,與繼發(fā)性產(chǎn)生的痰濁瘀毒相互影響,絡(luò)息成積,致使腎臟發(fā)生病理改變。所以,通絡(luò)干預(yù),恢復(fù)“絡(luò)以通為用”,是切合高血壓病腎損傷病機的治法。通心絡(luò)是基于中醫(yī)絡(luò)病學制定的通絡(luò)干預(yù)的代表方劑,具有益氣活血、通絡(luò)止痛的作用。實驗證據(jù)顯示通心絡(luò)在心腎損傷中具有抗氧化、抗炎、抗纖維化等多效性藥理作用。然而,通心絡(luò)對高血壓病腎損害的治療作用及機制研究尚少。在本實驗中,我們假設(shè)通心絡(luò)通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和FoxO1信號保護高血壓病腎損害。為了驗證這個假設(shè),我們評估了通心絡(luò)對SHR腎臟損傷的影響并進一步探討了其作用機制。研究目的1.觀察通心絡(luò)對SHR高血壓病腎損傷在結(jié)構(gòu)和功能的影響；2.探討通心絡(luò)對SHR腎臟氧化應(yīng)激與抗氧化機制的影響；3.探討通心絡(luò)對SHR高血壓病腎損傷的可能的作用機制,及其與FoxO1信號通路及其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制的關(guān)系。研究方法1.實驗動物的分組自發(fā)性高血壓大鼠作為原發(fā)性高血壓的動物模型。將20只8周齡雄性SHR隨機分為通心絡(luò)治療組,以及陽性對照組,每組各10只。10只8周齡Wistar Kyoto大鼠作為正常對照組。通心絡(luò)溶于生理鹽水配成溶液,通心絡(luò)治療組每天分別按每千克體重給予SHR0.38g通心絡(luò)溶液灌胃。正常對照組(WKY組)和陽性對照組(SHR組)每天給予等量生理鹽水灌胃。2.血壓的測量采用無創(chuàng)血壓計測量大鼠尾動脈壓。3.腎功能參數(shù)的測量采用ELISA法分析尿蛋白、血清和尿肌酐,并計算尿蛋白排泌率和肌酐清除率。4.組織病理學分析將大鼠腎臟標本制備為石蠟切片,進行腎臟糖原的PSA染色,并計算腎小球硬化指數(shù)。應(yīng)用免疫組織化學染色,觀察腎臟組織內(nèi)a-SMA、desmin、纖連蛋白、膠原Ⅳ和CD68的表達情況。5.氧化應(yīng)激損傷的標志物的檢測。應(yīng)用硫代巴比妥酸法測量丙二醛。應(yīng)用紫外光比色法測量蛋白質(zhì)羰基�？梢姺止夤舛确z測NAPDH氧化酶(NOX)的活性6.抗氧化能力的檢測。應(yīng)用羥胺法測定超氧化物歧化酶(SOD)的活性。應(yīng)用紫外光比色法測量過氧化氫酶活性。7.實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR收集各組別的腎臟組織并提取mRNA,進行逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR,檢測細胞及組織中NOX亞單位p47和p67 phox、SOD、過氧化氫酶、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平。8.蛋白印跡收集各組別的腎臟組織并提取蛋白,分別檢測FoxO1、phospho-FoxO1, ERK1/2 phospho-ERK1/2, P38、phospho-P38、PI3K、phospho-PI3K、Akt、 phospho-Akt、AMPK、phospho-AMPK、SIRT1、TGFβ1、SMAD3、phospho-SMAD3等蛋白的表達水平。9.統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示。兩組比較采用t檢驗；組間比較使用單因素方差分析法。以P0.05被認為有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果1.通心絡(luò)降低了SHR的血壓。與對照組比較,通心絡(luò)治療組的收縮壓顯著下降。2.通心絡(luò)減輕了SHR的腎功能損傷。與對照組比較,通心絡(luò)治療組的尿蛋白排泌率和肌酐清除率顯著下降。3.通心絡(luò)減輕了SHR腎臟氧化應(yīng)激損傷。與對照組比較,通心絡(luò)治療組的腎臟MDA、蛋白質(zhì)羰基、NOX活性及亞單位mRNA表達顯著減少。4.通心絡(luò)增加了SHR腎臟抗氧化能力。與對照組比較,通心絡(luò)治療組的SOD和過氧化物酶的活性及mRNA表達顯著增加。5.通心絡(luò)促進了SHR腎臟FoxO1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和活化。與對照組比較,通心絡(luò)顯著減少了ERK1/2和P38的磷酸化水平,并未顯著改變AMPK、P13K和Akt的磷酸化水平和SIRT1的表達。與對照組比較,通心絡(luò)治療組的FoxO1的磷酸化水平顯著減少。6.通心絡(luò)改善了SHR的腎臟結(jié)構(gòu)損傷。與對照組比較,通心絡(luò)治療組的GSI、足細胞損傷標志物desmin的表達、腎間質(zhì)纖維化顯著減少。與對照組比較,通心絡(luò)治療組的促纖維化信號通路蛋白TGF表達和Smad3的磷酸化水平。7.通心絡(luò)抑制了SHR腎臟的炎癥反應(yīng)與對照組比較,通心絡(luò)治療組的腎臟CD68的蛋白表達以及IL-6和TNFa的mRNA表達顯著減少。研究結(jié)論1.通心絡(luò)改善了高血壓病腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害；2.通心絡(luò)減輕了高血壓病腎臟氧化應(yīng)激損傷和炎癥,改善了腎臟的抗氧化能力；3.通心絡(luò)促進了高血壓病腎臟抗氧化信號FoxO1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和活化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1
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本文編號：2059578