本文選題：心肌梗死 + 心肌纖維化��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)后心肌重塑是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。心肌重塑涉及多個(gè)病理生理過程,其中包括：心肌細(xì)胞的凋亡和肥大,血管新生以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積。MI早期,心肌成纖維細(xì)胞在細(xì)胞因子的作用下,被招募到損傷區(qū)域,合成和分泌大量以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì),取代損傷壞死的心肌組織,穩(wěn)定心臟結(jié)構(gòu),防止心臟破裂。然而,過度的細(xì)胞外基質(zhì)沉積,在遠(yuǎn)期則會(huì)引起心肌纖維化,導(dǎo)致心室順應(yīng)性降低,嚴(yán)重影響心臟的收縮和舒張功能,最終造成心力衰竭。除此之外,心肌纖維化還可導(dǎo)致心肌電生理重構(gòu),誘導(dǎo)室性心律失常的發(fā)生,嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生活質(zhì)量。因此,如何調(diào)控心肌纖維化的進(jìn)程,成為改善心肌梗死后患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotention-aldosterone system, RAAS)在MI后心肌重塑中起著十分重要的作用。AngⅡ是RAAS系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)。研究表明,MI患者心肌組織中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)水平明顯升高。Ang Ⅱ通過與AT1受體結(jié)合,以自分泌／旁分泌的方式作用于心肌成纖維細(xì)胞,通過激活絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3 (signal transducer and activator of transcription3, STAT3)等信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移并刺激膠原的合成和沉積,最終導(dǎo)致心肌纖維化的形成。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞因子,結(jié)構(gòu)類似于IL-7,最早發(fā)現(xiàn)于胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞,分子量為29KD,主要表達(dá)于胸腺基質(zhì)細(xì)胞,上皮細(xì)胞,表皮角質(zhì)細(xì)胞,肥大細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。在外界刺激的作用下,上述細(xì)胞合成及分泌TSLP,通過與細(xì)胞表面TSLP受體(thymic stromal lymphopoietin receptor, TSLPR)結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。TSLPR為Ⅰ型跨膜蛋白,屬于造血細(xì)胞因子受體家族。功能型TSLPR以TSLPR和IL-7α受體復(fù)合物的形式存在和發(fā)揮作用,二者不可或缺。近來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn),TSLP在系統(tǒng)性硬化,瘢痕形成及哮喘病人氣道重塑中均具有促進(jìn)纖維化的作用。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)TSLP且在急性冠脈綜合征患者血清中TSLP水平明顯升高。既往研究表明在動(dòng)物體內(nèi)各器官組織中,心肌組織TSLP表達(dá)量最高。然而TSLP是否參與了MI后心肌纖維化的發(fā)生及其具體的分子機(jī)制,目前尚未見報(bào)道。因此,本研究擬在心肌成纖維細(xì)胞及小鼠心肌梗死模型中,系統(tǒng)研究TSLP在心肌梗死所致心肌纖維化中的作用及其可能的機(jī)制。研究目的1.研究心肌組織中TSLP在小鼠MI后心肌纖維化中的作用及其分子機(jī)制；2.研究TSLP對(duì)小鼠MI后心功能的影響；3.研究TSLP對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移及膠原合成能力的影響；研究方法1.慢病毒shRNA-TSLP載體構(gòu)建：構(gòu)建3種干擾TSLP表達(dá)的慢病毒載體,以攜帶亂序shRNA的慢病毒載體作為干擾空白對(duì)照。分別轉(zhuǎn)染小鼠乳鼠心肌成纖維細(xì)胞,選擇干擾效率最高的慢病毒為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。2. 動(dòng)物模型的建立及慢病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染8周齡C57小鼠(20-25g),適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,在2%異氟烷麻醉下,于胸骨左緣第4肋間開胸,將小鼠心臟擠出胸腔,用7.0號(hào)無(wú)損傷線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD),結(jié)扎線以下小鼠心肌組織變白,室壁活動(dòng)強(qiáng)度減弱,證明結(jié)扎成功。結(jié)扎LAD后,將25μL攜帶1×107UT的TSLP干擾序列慢病毒或?qū)φ战M慢病毒溶液分別分3點(diǎn)注射到心臟結(jié)扎部位周圍心肌組織中。術(shù)畢,將小鼠心臟還納回胸腔,擠壓掉胸腔中的空氣,關(guān)胸。術(shù)后4周,行心肌組織快速冰凍切片并置于顯微鏡下觀察病毒的轉(zhuǎn)染效率。留取心肌組織并在蛋白水平檢測(cè)TSLP的表達(dá)以確定抑制效果。3. 心臟功能的測(cè)定采用心臟二維超聲及M超成像技術(shù),通過測(cè)定左室收縮／舒張末期直徑,左室射血分?jǐn)?shù)及左室短軸縮短率評(píng)價(jià)小鼠心臟功能。4.組織學(xué)染色收集各組小鼠心臟,制備石蠟切片,進(jìn)行HE,Masson和天狼星紅染色分別顯示各組小鼠心臟的大體形態(tài)結(jié)構(gòu)、梗死面積及心肌內(nèi)膠原的含量。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察心肌組織中TSLP、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及TGF-β1的表達(dá)情況。5. 細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用新生1-3天的昆明小鼠乳鼠心臟分離和培養(yǎng)原代心肌成纖維細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?應(yīng)用AngⅡ、TSLP重組蛋白及TSLP中和抗體等刺激成纖維細(xì)胞,觀察其對(duì)細(xì)胞增值、遷移及膠原合成能力的影響。6. 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中TSLP及其受體TSLPR和IL-7R α的分布及表達(dá)。7. 蛋白印跡(Western blot)收集各組組織及細(xì)胞,提取蛋白,分別檢測(cè)TSLP, I型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、t-STAT3、p-STAT3、t-ERK、p-ERK、t-JNK、p-JNK、p38及p-p38等蛋白表達(dá)水平。8. 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定各組細(xì)胞上清及各組小鼠血清中TSLP水平。9. 細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)采用CCK8及EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞增殖情況。應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞的遷移能力。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析處理數(shù)據(jù),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。研究結(jié)果1.MI引起心肌組織中TSLP表達(dá)增加,且慢病毒轉(zhuǎn)染后抑制效果顯著Western blot及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,梗死周圍區(qū)心肌組織中,TSLP表達(dá)增加。與轉(zhuǎn)染對(duì)照組慢病毒相比,轉(zhuǎn)染攜帶干擾TSLP序列的慢病毒組小鼠心肌組織中TSLP表達(dá)明顯降低。2.抑制TSLP可顯著改善MI后心功能異常MI模型建立4周后,心臟超聲結(jié)果顯示左室內(nèi)徑增大,EF及FS較正常小鼠明顯降低,提示小鼠心功能減退,而抑制TSLP后心功能明顯改善。3.抑制TSLP明顯減輕MI誘導(dǎo)的心肌纖維化Masson染色及天狼星紅染色均提示MI后心肌組織發(fā)生明顯的纖維化。Western blot及免疫組織化學(xué)染色顯示心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著增高,而抑制TSLP后心肌纖維化程度明顯減輕。4. TSLP促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移及膠原合成細(xì)胞免疫熒光染色證實(shí)心肌成纖維細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)TSLP及其受體復(fù)合物。應(yīng)用不同濃度TSLP重組蛋白(5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml)刺激心肌成纖維細(xì)胞24h后結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,TSLP促進(jìn)了心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1蛋白的表達(dá)。EdU及CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,TSLP重組蛋白刺激可明顯增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。Tranwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TSLP重組蛋白刺激促進(jìn)了細(xì)胞遷移。5. AngⅡ促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)TSLP,抑制TSLP可減輕AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及膠原合成應(yīng)用不同濃度的AngⅡ刺激細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)AngⅡ劑量依賴性地促進(jìn)了TSLP的表達(dá)和分泌。應(yīng)用TSLP中和抗體預(yù)處理細(xì)胞,可明顯減輕AngⅡ誘導(dǎo)的膠原的合成及TGF-β1表達(dá)增加,同時(shí)細(xì)胞增殖也受到明顯抑制。6. TSLP促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞中STAT3及MAPK(JNK、ERK、p38)信號(hào)通路的磷酸化水平TSLP重組蛋白及AngⅡ刺激均可明顯增加心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)STAT3、MAPK(JNK、ERK、p38)的磷酸化水平。抑制TSLP后上述分子磷酸化水平明顯降低,提示STAT3、MAPK(JNK、ERK、38)信號(hào)通路的激活參與了TSLP介導(dǎo)的MI后心肌纖維化的發(fā)生。研究結(jié)論1.心肌梗死后,TSLP表達(dá)增加,抑制TSLP可改善心肌纖維化及心功能障礙；2. TSLP可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞遷移、增殖及合成膠原；3. Ang Ⅱ可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞合成和分泌TSLP,阻斷TSLP可明顯減輕AngⅡ?qū)π募±w維化的影響；4. TSLP介導(dǎo)心肌梗死后心肌纖維化的機(jī)制可能與STAT3及MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。研究背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)后心肌重塑涉及炎癥、心肌細(xì)胞凋亡、血管新生、成纖維細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積等諸多病理生理過程,最終導(dǎo)致心室形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的改變,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。心肌細(xì)胞凋亡是MI后心肌死亡的主要原因。心肌細(xì)胞凋亡程度與MI后心肌重塑及臨床癥狀直接相關(guān)。早期炎癥反應(yīng)為心梗后心臟修復(fù)所必須,然而過度的炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)心臟病理性重構(gòu)。細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積,在心肌修復(fù)早期,可以取代壞死的心肌組織,穩(wěn)定心臟結(jié)構(gòu),防止心臟破裂。然而在遠(yuǎn)期,可促進(jìn)心肌纖維化的形成,導(dǎo)致心室順應(yīng)性降低,心功能下降,最終發(fā)展為心力衰竭。心肌重塑是決定心梗患者預(yù)后的關(guān)鍵。尋求有效治療靶點(diǎn)成功調(diào)控心肌重塑,是改善心梗患者臨床癥狀,提高生活質(zhì)量的有效途徑。沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1 (silent information regulator of transcription 1,SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙�；�,是Sir2樣蛋白家族(sirtunits,包括SIRT1-SIRT7)中最主要的成員。SIRT1通過去乙酰化組蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等靶蛋白,組織特異性地調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥及纖維化等諸多病理生理過程。已有研究表明,SIRT1在心血管疾病中發(fā)揮著十分重要的作用。SIRT1的激活可通過減輕線粒體氧化應(yīng)激,改善心肌缺血／再灌注損傷。然而SIRT1在心梗后心肌重塑中的作用及其機(jī)制目前尚缺乏系統(tǒng)研究。姜黃素(curcumin, Cur)是從姜科植物中提取的有效植物化學(xué)物質(zhì)。研究表明,姜黃素具有抗炎、抗增殖、抗凋亡及抗氧化應(yīng)激等作用。姜黃素在心血管疾病中的保護(hù)作用已得到證實(shí)。已有研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可以調(diào)節(jié)SIRT1的活性。SIRT1活化是否介導(dǎo)了姜黃素心梗后的心肌保護(hù)作用目前尚未報(bào)道。因此,本研究擬采用結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立的心梗模型及AngⅡ刺激心肌成纖維細(xì)胞及H9C2心肌細(xì)胞系統(tǒng)研究姜黃素改善心梗后心肌重塑的作用及其具體機(jī)制。研究目的1.建立小鼠心肌梗死模型,明確姜黃素對(duì)心梗后心肌重塑的保護(hù)作用并初步探討SIRT1活化在姜黃素心肌保護(hù)中作用;2.體外研究中,明確SIRT1在心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化中的作用；研究方法1.動(dòng)物模型的建立8周齡C57小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將動(dòng)物隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組(sham)、假手術(shù)+姜黃素100 mg/kg (sham+Cur)、心梗模型組(MI)、心梗模型+姜黃素100mg/kg組(MI+Cur)。1周后,在2%異氟烷麻醉下,開胸,將小鼠心臟擠出胸腔,結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD),術(shù)畢,將小鼠心臟還納回胸腔,擠壓掉胸腔中的空氣,關(guān)胸。2.心臟功能的測(cè)定采用心臟二維超聲及M超成像技術(shù),通過測(cè)定左室收縮／舒張末期直徑,左室射血分?jǐn)?shù)及左室短軸縮短率評(píng)價(jià)小鼠心臟功能。3.組織學(xué)染色收集各組小鼠心臟,制備石蠟切片,進(jìn)行HE, Masson和天狼猩紅染色。HE染色用于評(píng)估心臟大體形態(tài)及心肌細(xì)胞直徑的變化。Masson和天狼星紅染色用于評(píng)價(jià)膠原沉積情況及計(jì)算心肌梗死面積。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察心肌組織中SIRT1、I型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1蛋白的表達(dá)情況。4.心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)利用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組小鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡水平。5.細(xì)胞培養(yǎng)以H9C2大鼠心肌細(xì)胞系及新生1-3天的Wistar乳鼠心臟提取的心肌成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象。AngⅡ刺激細(xì)胞體外模擬心梗后狀態(tài),以不同濃度的姜黃素預(yù)處理細(xì)胞,觀察姜黃素對(duì)心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化的保護(hù)作用。設(shè)計(jì)SIRT1-siRNA,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞沉默SIRT1。同時(shí)應(yīng)用SIRT1抑制劑sirtinol預(yù)處理細(xì)胞,觀察SIRT1活化在姜黃素介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化保護(hù)中的作用。6.蛋白印跡收集各組組織及細(xì)胞提取蛋白,分別檢測(cè)Bax, Bcl-2, caspase3、TNF-α、 IL-6、Ac-FOX01、SIRT1、 collagen Ⅰ、collagenⅢ、TGF-β1、MMP2、MMP9等蛋白表達(dá)水平。7.明膠酶譜采用明膠酶譜法檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞中MMP2及MMP9的活性。8.細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞增殖情況。利用Transwell小室檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞的遷移。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析處理數(shù)據(jù),并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。研究結(jié)果1.姜黃素減輕了心梗后心肌重塑與假手術(shù)組相比,心梗后,心臟形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,表現(xiàn)為心身重量比(HW/BW)增加,左室明顯擴(kuò)張,鏡下觀察,HE染色顯示心肌細(xì)胞肥大,排列紊亂,細(xì)胞間隙增加；Masson染色及天狼猩紅染色結(jié)果顯示心梗后心肌組織中膠原沉積增加,膠原排列紊亂；免疫組織化學(xué)染色顯示心梗后小鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及TGF-β1表達(dá)增加。Western blot結(jié)果顯示心肌組織中炎癥反應(yīng)標(biāo)志物IL-6、TNF-α及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2,caspase3表達(dá)增加,與免疫組織化學(xué)染色及TUNEL染色結(jié)果一致。姜黃素干預(yù)治療顯著改善了心梗后心肌重塑。同時(shí)Western blot及免疫組織化學(xué)染色證實(shí)姜黃素增加了心肌組織中SIRT1蛋白的表達(dá)。2.姜黃素改善了心梗后左室功能障礙心梗后4周,超聲檢測(cè)小鼠心功能發(fā)現(xiàn),MI組小鼠心功能顯著降低,具體表現(xiàn)為左室內(nèi)徑增大,EF及FS較正常小數(shù)明顯降低,而姜黃素干預(yù)治療顯著改善心梗小鼠左室功能障礙。3.姜黃素預(yù)處理減少了AngⅡ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡100 nmol/L AngⅡ刺激H9C2心肌細(xì)胞48小時(shí)后,Western Blot結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白caspase3表達(dá)明顯升高,Bax/Bcl-2比值顯著增加；姜黃素預(yù)處理劑量依賴性的減輕了上述變化,同時(shí)發(fā)現(xiàn)姜黃素促進(jìn)了細(xì)胞中SIRT1表達(dá),并降低下游Ac-FOX01的蛋白表達(dá)。4.抑制SIRT1減弱了姜黃素對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用分別采用SIRT1-siRNA基因沉默及SIRT1抑制劑(sirtinol)處理細(xì)胞,與單純AngⅡ刺激組相比,抑制SIRT1顯著增加了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。證實(shí)SIRT1在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中具有保護(hù)作用同時(shí)發(fā)現(xiàn)抑制SIRT1后姜黃素對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用明顯減弱。5.姜黃素預(yù)處理改善了AngⅡ刺激誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞纖維化分別采用1、10、100 nmol/L的AngⅡ刺激心肌成纖維細(xì)胞12、24及48h,觀察對(duì)心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的影響。Western blot結(jié)果顯示AngⅡ?qū)δz原合成的影響成劑量和時(shí)間依賴性。選擇100 nmol/L AngⅡ刺激24h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件。姜黃素預(yù)處理劑量依賴性地降低了膠原的合成及細(xì)胞外基質(zhì)的降解。Western blot結(jié)果顯示：Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及TGF-β1的表達(dá)降低；MMP2、 MMP9的表達(dá)及活性顯著降低；CCK8實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,姜黃素顯著抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增殖及遷移。6.抑制SIRT1減弱了姜黃素抗心肌纖維化的作用采用SIRT1-siRNA基因沉默法抑制SIRT1表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)膠原合成及細(xì)胞外基質(zhì)的降解明顯增加并且促進(jìn)了心肌成纖維細(xì)胞增殖及遷移。姜黃素的抗心肌纖維化作用明顯減弱。研究結(jié)論1.MI后,姜黃素通過活化SIRT1改善心肌重塑及心功能異常；2.姜黃素通過活化SIRT1減輕AngⅡ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡；3.姜黃素通過活化SIRT1抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移及膠原合成。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.22
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本文編號(hào)：2037548