本文選題：心肌肥厚 + 細胞色素P450��； 參考：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景心肌肥厚是心臟對于壓力負荷或者容量負荷所產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng),是一種緩慢、復(fù)雜而且合并諸多因素參與的動態(tài)過程,通常是由心臟的基礎(chǔ)疾病如心臟瓣膜病、高血壓病、先天性心臟病、心肌缺血等導(dǎo)致。心肌肥厚在宏觀上主要表現(xiàn)為心室腔縮小、心室壁增厚,而在微觀上則以心肌細胞增大、心肌纖維增粗或者成簇樣改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)。在心肌肥厚發(fā)生的早期,其可以降低心室壁的壓力,維持心臟的功能,保證外周組織器官的血供。然而隨著壓力或者容量負荷的持續(xù)存在,心肌肥厚的進一步進展,伴隨著心肌細胞凋亡、心肌纖維化等的發(fā)生,其終將發(fā)展成心力衰竭,甚至導(dǎo)致死亡。因此,深入探討心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制、尋找心肌肥厚的有效治療靶點和治療策略,具有非常重要的意義�；ㄉ南┧崾巧矬w內(nèi)含量最為豐富的不飽和脂肪酸之一。它可通過細胞色素P450表氧化酶代謝途徑代謝成為環(huán)氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids, EETs)。研究證實,EETs在心血管系統(tǒng)中有著諸多的保護作用,比如EETs可以舒張血管、降低血壓,可以抑制動脈粥樣硬化以及抑制主動脈瘤形成等。同時,研究還表明,EETs在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程中具有良好的保護作用,可以預(yù)防心肌肥厚的發(fā)生,甚至達到治療心肌肥厚以及心力衰竭的目的。然而截至目前,EETs抵抗心肌肥厚的具體作用機制尚未明了。結(jié)合國內(nèi)外的研究,我們推測過氧化物酶體增殖物激活受體α (Peroxisome Proliferator Activated Receptor alpha, PPARa)很有可能介導(dǎo)了EETs的抗心肌肥厚作用。因此,本課題以PPARa缺陷(PPARa null)小鼠作為研究對象,通過重組腺相關(guān)病毒(recombinant Adeno Associated Virus, rAAV)系統(tǒng)介導(dǎo)小鼠心臟高表達CYP2J2基因以及對照的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein GFP)基因,并采用血管緊張素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)皮下微泵植入誘導(dǎo)心肌肥厚,以探討CYP 2J2過表達對心肌肥厚的作用及其與PPARa的關(guān)系,并對其分子機制進行深入探索。研究方法和結(jié)果：1.首先,我們在293T細胞中通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法成功包被攜帶有CYP 2J2基因和GFP基因的的重組腺相關(guān)病毒,即rAAV-2J2和rAAV-GFP,并對其進行純化。純化后將其感染細胞檢測感染效率,并且通過尾靜脈注射注入至動物體內(nèi),4周后留取動物的心臟、血液和尿液,采用Western blot技術(shù)和real time RT-PCR的方法檢測心臟組織中CYP 2J2的蛋白和mRNA的水平,并采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測小鼠血、尿中11,12-EET、11,12-DHET、14,15-EET以及14,15-DHET的水平。結(jié)果表明,我們所包被的病毒具有很高的感染效率,而且其可以介導(dǎo)CYP2J2在小鼠心臟中表達,同時與對照組相比,接受rAAV-2J2病毒組的血、尿中EETs和DHETs的水平明顯升高。2.為了驗證CYP2J2介導(dǎo)的抗心肌肥厚作用是否與PPARα有關(guān),我們以8周大的雄性PPARαnull小鼠以及相同背景的野生(Wild type, WT)小鼠作為研究對象,并通過小鼠尾靜脈注射攜帶有CYP 2J2基因和GFP基因的重組腺相關(guān)病毒,采用皮下微泵植入給予Ang Ⅱ (1.5 μg·Kg-1·min-1)持續(xù)刺激。兩種小鼠均分為如下4組：NS+ rAAV-GFP組、NS+rAAV-2J2組、Ang Ⅱ+rAAV-GFP組、Ang Ⅱ+rAAV-2J2組,每組8只。在Ang Ⅱ干預(yù)兩周后,通過小鼠超聲系統(tǒng),對小鼠的心室腔大小和心室壁厚度等進行檢測。并且通過心導(dǎo)管技術(shù)以及Millar系統(tǒng)對小鼠的心臟血液流變學(xué)功能進行檢測。檢測結(jié)果表明,無論是在WT小鼠還是PPARa null小鼠中,Ang Ⅱ可以明顯的誘導(dǎo)小鼠心臟心室壁增厚,心室腔縮小以及心室內(nèi)壓力最大變化速率降低。同時,在WT小鼠中,CYP 2J2過表達可以明顯的抑制Ang Ⅱ的作用,但是在PPARa null小鼠中,CYP2J2卻不能發(fā)揮抑制Ang Ⅱ的效應(yīng)。3.在上述檢測之后,將動物人性化處死并分離心臟,觀察心臟大小,記錄心臟重量。采用蘇木素-伊紅染色以及WGA染色觀察小鼠心肌細胞面積,同時應(yīng)用real time RT-PCR方法對小鼠心臟組織中心肌肥厚標志物(βMHC和BNP)進行檢測,并提取心臟的總蛋白和胞漿胞核蛋白組分,采用Western blot技術(shù)檢測心臟中ERK1/2.MAPK的激活水平,IκBα的表達情況和NFκB的激活情況。結(jié)果顯示,無論是在野生小鼠還是PPARa null小鼠,Ang Ⅱ可以明顯的誘導(dǎo)心臟增大、增重,促進心肌細胞面積增大,誘導(dǎo)心肌肥厚標志物(βMHC和BNP)的表達,并促進MAPK (ERK1/2、MAPKP38)和IκBα的激活,促進NFκB的核轉(zhuǎn)移。而且在WT小鼠中,將Ang Ⅱ+rAAV-GFP組與Ang Ⅱ+rAAV-2J2組相比,CYP2J2過表達可以抑制心臟增大、增重,抑制心肌細胞面積的增大以及PMHC和BNP的表達增加,這一作用可能與其抑制MAPK和NFκB通路的激活有關(guān)。然而,在PPARa null小鼠中,CYP2J2過表達卻不能發(fā)揮類似的效應(yīng)。4.另外,我們還以大鼠心肌細胞系H9c2細胞以及原代提取的大鼠乳鼠心肌細胞作為研究對象,并外源性加入EETs以及PPARa特異性阻斷劑GW6471,觀察EETs對于Ang Ⅱ的促心肌肥大的作用。在體外研究中,我們采用F-actin染色觀察心肌細胞的面積,并采用real time RT-PCR方法對心肌細胞中PMHC和BNP的表達進行檢測,同時提取細胞總蛋白和胞漿胞核蛋白組分,采用Wenstern blot技術(shù)檢測細胞中Cav-1、ERK1/2、MAPK-P38以及IKBα的激活情況和胞漿胞核NFκB的表達。此外,我們還采用了免疫沉淀的方法,檢測細胞中Ras-GTP的表達,即Ras的激活情況。研究結(jié)果表明,與對照組相比,單純Ang Ⅱ刺激可以明顯的誘導(dǎo)的心肌細胞增大,誘導(dǎo)細胞中PMHC和BNP的表達增加,同時激活了Ras/MAPK和NFκB通路,而加入11,12-EET干預(yù)可以顯著的抑制Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的心肌細胞增大、抑制βMHC和BNP的表達、抑制Ras/MAPK和NFκB通路的激活,然而11,12-EET拮抗Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大的這一效應(yīng),可以被14,15-EEZE以及PPARa特異性阻斷劑GW6471所阻斷。同時我們還觀察到,11,12-EET干預(yù)可以明顯的誘導(dǎo)Cav-1的表達,而GW6471則可以阻斷11,12-EET的作用。以上結(jié)果表明,11,12-EET可以通過PPARa調(diào)控Cav-1的表達。5.為了進一步的驗證PPARa與Cav-1表達調(diào)控之間的關(guān)系,我們通過轉(zhuǎn)錄預(yù)測網(wǎng)站在Cav-1啟動子的保守區(qū)預(yù)測到了PPARa的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點,構(gòu)建了含有不同長度的Cav-1的啟動子區(qū)的截短克隆,通過PPARa在細胞中高表達PPARa并采用熒光報告基因系統(tǒng)檢測PPARa是否可以結(jié)合Cav-1的啟動子區(qū)并啟動下游基因的表達。同時,我們還使用了染色質(zhì)免疫沉淀的方法,以Cav-1啟動子區(qū)的多段引物進行PCR反應(yīng),再次驗證檢測PPARa與Cav-1啟動子區(qū)是否可以結(jié)合。研究結(jié)果表明,對于上游500bp(-8到-492)以及上游1250bp(-8到-1278)的截短克隆中,與對照組相比,PPARa高表達組熒光素酶活性顯著增高。染色質(zhì)免疫沉淀的結(jié)果也表明,與對照組相比,PPARα高表達組中可以擴增出更多的-199至-455的Cav-1啟動子片段,而其他引物所擴增出的產(chǎn)物在兩組間沒有明顯的差異。因此,我們的結(jié)果表明,PPARα可以與Cav-1啟動子區(qū)的-199到-455區(qū)域發(fā)生結(jié)合,促進Cav-1的表達。6.最后,我們在原代提取的大鼠乳鼠心肌細胞中,采用siRNA介導(dǎo)Cav-1的沉默,并使用F-actin染色、real time RT-PCR方法以及Western blot方法觀察Cav-1在EET發(fā)揮抗心肌肥厚過程中的作用。結(jié)果表明,與對照組相比,Ang Ⅱ可以明顯的促進心肌細胞面積增大、βMHC以及BNP的表達增加,刺激MAPK和NFκB通路的激活,將Ang Ⅱ組與Ang Ⅱ+11,12-EET組相比,11,12-EET干預(yù)可以顯著的抑制Ang Ⅱ的效應(yīng),但是將Ang Ⅱ+11,12.EET組與Ang Ⅱ11,12-EET+Cav-1 siRNA組相比,Cav-1沉默可以顯著的抑制11,12-EET的作用,促進Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的心肌肥大.結(jié)論：1.在體內(nèi)研究中,Ang Ⅱ微泵植入可以明顯的誘導(dǎo)心肌肥厚,包括心臟的形態(tài)學(xué)改變(心室壁增厚、心臟增大)、血液流變學(xué)改變(心室內(nèi)壓力變化速率下降、心室舒張未期壓力增高等)、病理學(xué)改變(心肌細胞面積增大)和分子層面改變(心肌肥厚標志物表達增加),而Ang ⅡCYP 2J2過表達可以明顯的抑制Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的心肌肥厚,并且這一作用可能是由PPARa介導(dǎo)的；2.在離體研究中,Ang Ⅱ干預(yù)可以明顯的刺激心肌細胞發(fā)生心肌肥大,外源性加入11,12-EET可以明顯的抑制Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的心肌肥大,而這一效應(yīng)可以被PPARa特異性阻斷劑GW6471所阻斷。3. CYP 2J2過表達及其代謝產(chǎn)物EETs可以通過激活PPARa,上調(diào)Cav-1的表達,進一步抑制Ras的活性以及MAPK(ERK1/2以及MAPK-P38)的激活,同時抑制IκBα的降解以及NFκB-P65亞基的核轉(zhuǎn)移,從而抑制AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌肥厚。
[Abstract]:Cardiac hypertrophy is a kind of dynamic process which is slow , complex and complicated with many factors . It is usually caused by heart disease such as valvular heart disease , hypertension , congenital heart disease , myocardial ischemia , etc . This study has shown that EETs has many protective effects in cardiovascular system , such as the effect of EETs on myocardial hypertrophy and the inhibition of aortic aneurysm formation . The results showed that , in WT mice and PPARa null mice , the effects of Ang 鈪，

本文編號：1996313