既往的研究已經(jīng)表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA (LncRNA)參與人類許多疾病的發(fā)生和發(fā)展,如癌癥、HELLP綜合征和短指綜合征。然而,LncRNA在心力衰竭(HF)中的研究報(bào)道較少。因此,我們研究了PDK1基因心肌特異性敲除(KO)小鼠心力衰竭模型的心臟組織中LncRNA的表達(dá)譜變化。我們分別取出生后第8天(P8)和第40天(P40)的PDK1基因敲除(KO)和野生型(WT)小鼠的心臟標(biāo)本,通過(guò)Arraystar LncRNA基因芯片進(jìn)行LncRNA表達(dá)譜的分析篩選。KO組和WT組芯片的結(jié)果表明：在P8,表達(dá)水平變化大于1.5倍的有2024個(gè)LncRNA,而在P40,表達(dá)水平變化大于2倍的有4059個(gè)LncRNA。我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR (RT-PCR)驗(yàn)證了隨機(jī)選擇的19個(gè)LncRNAs基因表達(dá)水平的變化。同時(shí)生物信息學(xué)分析表明：mkk7,一個(gè)順義重疊LncRNA,可能通過(guò)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與到心力衰竭的病理過(guò)程中。我們推測(cè)這些差異表達(dá)的LncRNA可能參與了PDK1基因心肌特異敲除小鼠心衰過(guò)程的發(fā)生發(fā)展。 第一部分PDK1基因敲除小鼠心衰時(shí)心臟組織中LncRNA的篩選 目的：了解PDK1基因敲除小鼠心衰時(shí)心臟組織中LncRNA表達(dá)水平是否發(fā)生變化。 方法：剪小鼠尾巴裂解,抽提DNA, PCR法鑒定心肌中特異敲除(KO)的小鼠,Western blot法驗(yàn)證PDK1蛋白敲除水平。取出生后40天PDK1基因KO和WT小鼠各三個(gè)心臟組織混合樣本,送公司做Arraystar LncRNA芯片,通過(guò)生物信息學(xué)分析,篩選出可能跟心衰相關(guān)的LncRNA,應(yīng)用RT-PCR驗(yàn)證篩選結(jié)果。 結(jié)果：1)一共有4059個(gè)LncRNAs表達(dá)水平變化大于2倍；2)其中,2094個(gè)LncRNAs上調(diào),1965個(gè)LncRNAs下調(diào)；3)隨機(jī)驗(yàn)證6個(gè)LncRNA的結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)且與芯片結(jié)果一致。 結(jié)論：1)PDK1基因敲除小鼠心衰時(shí)心臟組織的LncRNA表達(dá)水平確實(shí)發(fā)生了變化。 第二部分PDK1基因穩(wěn)定敲除小鼠心衰前心臟組織中LncRNA的篩選 目的：了解PDK1基因敲除小鼠心衰前心臟組織中LncRNA表達(dá)水平的變化。 方法：PDK1基因敲除小鼠鑒定同前；取心臟組織特異性敲除(KO)小鼠和同年齡野生型(WT)小鼠為研究對(duì)象,觀察出生第6天、第8-9天小鼠心臟PDK1蛋白水平；PDK1蛋白水平穩(wěn)定敲除后,稱量心臟重量和體重,計(jì)算心臟重量指數(shù)(HW/BW);光鏡下觀察心臟的整體外觀變化；組織切片觀察心臟形態(tài)變化,超聲心動(dòng)圖檢測(cè)評(píng)估小鼠心臟功能變化。取PDK1基因KO和WT小鼠各三個(gè)心臟組織混合樣本,送公司做Arraystar LncRNA芯片,通過(guò)生物信息學(xué)分析,篩選出可能跟心衰相關(guān)的LncRNA,應(yīng)用RT-PCR驗(yàn)證篩選結(jié)果并與芯片結(jié)果比較。 結(jié)果：1)在出生第9天時(shí),PDK1蛋白在心臟組織中穩(wěn)定敲除；2)KO小鼠與WT小鼠的心臟重量指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3)KO小鼠和WT小鼠的心臟外觀無(wú)明顯差異；4)KO小鼠和WT小鼠的心臟切片形態(tài)無(wú)明顯差異；5)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KO小鼠的心臟功能也無(wú)明顯變化；6)有2024個(gè)LncRNAs表達(dá)水平變化大于1.5倍；7)其中1224個(gè)LncRNAs變化上調(diào),800個(gè)LncRNAs變化下調(diào)；8)隨機(jī)驗(yàn)證的5個(gè)LncRNAs有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)且與芯片結(jié)果一致。 結(jié)論：1)PDK1基因穩(wěn)定敲除小鼠與野生型小鼠相比,心臟整體外觀、心臟形態(tài)功能與WT小鼠比較均無(wú)明顯差異；2)KO小鼠心臟體重指數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異；3)雖然PDK1基因穩(wěn)定敲除小鼠未發(fā)展為心衰狀態(tài),但心臟組織中LncRNA的表達(dá)水平確實(shí)發(fā)生了變化,并且部分通過(guò)RT-PCR得到了驗(yàn)證。 第三部分PDKl基因敲除小鼠心衰前與心衰時(shí)心臟組織中LncRNA的對(duì)比篩選及其相關(guān)機(jī)制的研究 目的：篩選出PDKl基因敲除小鼠在心衰發(fā)展過(guò)程中的變化的LncRNA,同時(shí)探討LncRNA在心衰發(fā)展過(guò)程中可能的作用機(jī)制。 方法：以第一、二部分芯片結(jié)果為基礎(chǔ),進(jìn)行對(duì)比篩選,并且通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證篩選出的LncRNA的表達(dá)水平變化。后通過(guò)LncRNA的靶標(biāo)mRNA的GO和Pathway的生物信息學(xué)分析來(lái)探討可能的作用機(jī)制。 結(jié)果：對(duì)比篩選的結(jié)果如下：1)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上同時(shí)上調(diào)的有93個(gè)LncRNAs;2)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上同時(shí)下調(diào)的有52個(gè)LncRNAs;3)先在P8天上調(diào)后在P40天下調(diào)的有136個(gè)LncRNAs;4)先在P8天下調(diào)后在P40天上調(diào)的有51個(gè)LncRNAs;5)隨機(jī)驗(yàn)證了8個(gè)LncRNAs均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)且與芯片結(jié)果一致。生物信息學(xué)分析的結(jié)果如下：1)在P8天,有9個(gè)與心臟功能相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)生了變化,其中包括MAPKsignaling、Cell adhesion molecules和Calcium signaling pathway (P0.05);2)在P40天,有10個(gè)影響心臟功能的信號(hào)通路發(fā)生了變化,其中包括MAPK和Cell adhesion molecules Pathway (P0.05);3)篩選發(fā)現(xiàn)一條順義重疊的LncRNA(mkk7),分析發(fā)現(xiàn)可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路參與心衰的病理過(guò)程。 結(jié)論：1)PDKl基因敲除小鼠在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上即心衰發(fā)生前后,LncRNA表達(dá)水平發(fā)生多種情況的變化,推測(cè)可能參與了心衰的發(fā)生發(fā)展；2)在心衰的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中, LncRNA的靶標(biāo)mRNA參與的信號(hào)通路發(fā)生變化；3)mkk7可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路參與心衰的發(fā)生發(fā)展。

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R541.6
【目錄】：

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