本文選題：血管再狹窄 + 大鼠�。� 參考：《東南大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分ILK在頸動脈球囊損傷大鼠模型中的表達變化目的：經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)是目前治療冠心病最為有效的方法,然而PCI術(shù)后血管再狹窄(Restenosis,RS)的發(fā)生制約了PCI的臨床療效,并嚴重影響了冠心病患者的臨床預(yù)后。血管平滑肌細胞(Vasclar Smooth Muscle Cell,VSMC)的過度增殖和遷移是導(dǎo)致RS最為主要的原因,而VSMC由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換是血管損傷后VSMC過度增殖、遷移的始動環(huán)節(jié)。既往研究表明ILK是維持VSMC收縮表型所必須的基因之一。本部分研究旨在明確大鼠頸動脈血管損傷后再狹窄過程中ILK的表達變化。方法：大鼠頸動脈球囊損傷模型是目前研究血管損傷后內(nèi)膜新生的最佳模型,本部分采用直徑1.5-2.0 mm PTCA球囊導(dǎo)管建立大鼠頸動脈球囊損傷RS模型。分別進行以下實驗：(1)通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中ILK表達水平；(2)Real-time PCR檢測頸動脈血管ILK及PCNA mRNA水平的情況；(3)Western blot檢測VSMC表型標記物及ILK蛋白表達變化；(4)免疫熒光染色觀察頸動脈ILK及SM a-actin的表達及定位。結(jié)果：大鼠球囊損傷術(shù)后新生內(nèi)膜明顯向管腔內(nèi)增生,細胞外基質(zhì)增加,內(nèi)膜繼續(xù)增厚,造成明顯的管腔狹窄。具體結(jié)果如下：(1)損傷后7天血清ILK水平較術(shù)后即刻明顯降低達30.8%(P0.05),損傷后14天ILK水平較7天時進一步降低(P0.05)。(2)損傷后7天PCNA mRNA水平較損傷后明顯增加,損傷后14天PCNA mRNA進一步增加(P均0.05)；而ILK mRNA水平在7、14天后顯著降低分別達36%、48%(P均0.05)；(3)損傷后7天、14天Osteoptin蛋白水平較損傷后即刻增加34%、42%(P均0.05);術(shù)后7天、14天Calponin蛋白水平顯著降低分別達22%、56%(P均0.05);術(shù)后7天、14天SM a-actin蛋白水平分別降低26%、32%(P均0.05)。(4)損傷后7天、14天PCNA蛋白水平較損傷后即刻增加130%、270%(P均0.05)；損傷后14天PCNA蛋白進一步增加(P0.05),而術(shù)后7天、14天ILK蛋白水平顯著降低分別達50%、88%(P均0.05),損傷后14天ILK蛋白水平較7天時進一步降低(P0.05)。(5)正常頸動脈內(nèi)ILK在血管平滑肌細胞胞漿中表達豐富,損傷14天后,頸動脈平滑肌細胞內(nèi)ILK表達明顯減少。結(jié)論：ILK在成年大鼠頸動脈血管平滑肌細胞層胞漿內(nèi)大量表達,大鼠頸動脈球囊損傷術(shù)后SMC增殖明顯,SMC合成基因增加而收縮表型標記物蛋白表達下調(diào),同時血清ILK濃度以及血管內(nèi)ILK mRNA和蛋白水平均一致性呈現(xiàn)明顯的降低趨勢。第二部分ILK參與VSMC表型轉(zhuǎn)換的分子機制研究目的：VSMC由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換是血管損傷后VSMC過度增殖、遷移的始動環(huán)節(jié)。血小板衍生生長因子BB(Platelet Derived Growth Factor BB, PDGF-BB)是VSMC表型調(diào)節(jié)的主要因子之一。位于SMC標志基因啟動子的CArG盒子[CC(A/T)6GG] DNA序列在調(diào)節(jié)SMC標志基因的轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵的作用,血清效應(yīng)因子(Serum Response Factor,SRF)只有與CArG盒子DNA結(jié)合,才能夠激活參與SMC分化和增殖基因的轉(zhuǎn)錄表達。Myocardin可與SRF結(jié)合,激活SRF-CArG相互作用,促進SMC收縮基因的表達和分化；而轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1(ETS-like 1,Elk-1)作為另一個主要的SRF輔激活因子,在胞質(zhì)信號調(diào)控下磷酸化,競爭性取代Myocardin與SRF的相合,形成Elk-1/SRF復(fù)合物,引起SMC收縮基因啟動子與Elk-1的結(jié)合增加而Myocardin結(jié)合降低,收縮基因表達下調(diào),并導(dǎo)致SMC向合成表型轉(zhuǎn)換。我們前期在體研究己證實ILK在成年大鼠頸動脈血管平滑肌細胞層胞漿內(nèi)大量表達,而大鼠頸動脈球囊損傷RS模型中ILK濃度以及血管內(nèi)ILKmRNA口蛋白水平均一致性顯著降低。研究表明ILK是維持SMC收縮表型所必須的基因之一,但有關(guān)ILK影響VSMC表型轉(zhuǎn)換的分子機制研究尚不清楚。我們推測ILK可能通過影響Myocardin參與VSMC的表型轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié),影響RS的發(fā)生與發(fā)展。方法：具體的方法包括：原代大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞的培養(yǎng)；腺病毒表達載體及質(zhì)粒載體的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染；ILK小干擾RNA(SiRNA)質(zhì)粒的構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染；F-actin細胞骨架染色；ILK激酶活性測定；免疫共沉淀分析(Coimmunoprecipitation,Co-IP);雙熒光素酶報告基因分析；染色質(zhì)免疫共沉淀分析(Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP);實時熒光定量PCR及Western blot分析等。結(jié)果：1.ILK在PDGF-BB短期干預(yù)誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)換過程的作用及機制PDGF-BB(25ng/mL)預(yù)孵育VSMC細胞1h,發(fā)現(xiàn)：(1)PDGF-BB可以顯著抑制ILK激酶活性。(2)Western blot分析結(jié)果顯示,PDGF-BB干預(yù)VSMC 1h明顯促進Elk-1磷酸化,而對ILK及Myocardin蛋白表達水平無影響。(3)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)PDGF-BB短期干預(yù)導(dǎo)致Elk-1競爭性取代Myocardin與SRF的相合,導(dǎo)致Myocardin與SRF結(jié)合減少,而Elk-I與SRF結(jié)合增多。(4)采用ChIP實驗發(fā)現(xiàn)Myocardin與SM a-actin基因啟動子結(jié)合減少,而Elk-1與SM a-actin啟動子結(jié)合增多。2.ILK在PDGF-BB長期干預(yù)誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)換過程的作用及機制以VSMC表型標志基因如SM a-actin、SM 22a、Calponin及Osteoptin表達水平作為判定VSMC表型的指標,并通過F-actin染色評估不同表型VSMC形態(tài)差異。一方面,通過ILK-SiRNA技術(shù)阻斷內(nèi)源性ILK的表達后,觀察VSMC標志基因及形態(tài)的影響;另一方面,通過Ad-ILK腺病毒轉(zhuǎn)染VSMC過表達ILK后。觀察ILK對PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC表型變化的影響,結(jié)果如下。2.1.PDGF-BB對SMC標志基因及ILK、Myocardin蛋白等影響PDGF-BB(25ng/ml)孵育VSMC 48h后,SM a-actin、SM 22a和Calponin蛋白表達均被顯著抑制(與對照組相比較,P均0.05),而去分化基因Osteoptin蛋白表達則明顯升高,但與對照組比較無統(tǒng)計差異(P0.05)；同時發(fā)現(xiàn)PDGF-BB亦引起ILK及Myocardin蛋白表達下調(diào)(與對照組相比較,P均0.05),而對Elk-1及SRF等蛋白表達無影響(與對照組相比較,P均0.05)。2.2.ILK是維持VSMC分化表型所必須基因之一VSMC轉(zhuǎn)染SiRNA-ILK可使ILK蛋白表達水平降低達68%(P0.05),同時顯著降低了Myocardin蛋白的表達(P0.05)。通過實時熒光定量PCR及Western blot檢測均表明,轉(zhuǎn)染SiRNA-ILK的VSMC中,分化標志基因SMa-actin、SM 22a及Calponin的mRNA及蛋白水平呈一致性下降,且明顯降低了TGF-β誘導(dǎo)的上述分化標志基因表達的上調(diào)。VSMC在通過SiRNA轉(zhuǎn)染抑制ILK表達后,細胞體積增大,而F-actin呈短小的束狀,無規(guī)則散在分布于細胞內(nèi),交錯無序排列。以上結(jié)果表明ILK是VSMC分化標志基因表達所必須的基因之一,且參與了VSMC細胞內(nèi)應(yīng)力纖維束的組裝及重排。2.3.ILK過表達阻遏PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC去分化轉(zhuǎn)換通過構(gòu)建Ad-ILK過表達病毒載體并轉(zhuǎn)染VMSC 24h后,免疫熒光檢測顯示,Ad-ILK組ILK熒光強度較Ad-GFP對照組明顯增強；Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與Ad-GFP感染組比較,Ad-ILK感染組ILK蛋白表達水平上調(diào)70%,同時Ad-ILK感染組Myocardin蛋白水平增加近31%;說明Ad-ILK轉(zhuǎn)染VSMC顯著促進ILK過表達后可明顯增強Myocardin蛋白表達。通過實時熒光定量PCR及Western blot檢測均表明,轉(zhuǎn)染Ad-ILK的VSMC中,分化標志基因SMa-actin、SM 22a及Calponin的mRNA及蛋白水平呈一致性上調(diào),而VSMC去分化標志物Osteopontin蛋白表達與分化標志基因的表達情況正好相反。VSMC轉(zhuǎn)染Ad-ILK后,胞質(zhì)內(nèi)F-actin由隨機散亂的束狀縱向平行排列,形成整齊的應(yīng)力纖維,使VSMC細胞形態(tài)向紡錘形轉(zhuǎn)化,維持VSMC的分化狀態(tài)。以上結(jié)果表明ILK過表達可明顯逆轉(zhuǎn)去分化因子PDGF-BB引起的SMC分化標志基因mRNA及蛋白水平的下調(diào),部分阻遏PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC去分化。2.4.ILK逆轉(zhuǎn)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC去分化信號機制本部分采用熒光素酶報告基因分析及ChIP檢測評價ILK在PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC去分化信號中的具體機制。具體結(jié)果如下：(1)通過SMC標志基因啟動子熒光素酶報告基因分析表明,與Ad-GFP組比較,PDGF-BB干預(yù)可顯著降低SM a-actin及Calponin的啟動子活性(P均0.05)。過表達ILK則可明顯逆轉(zhuǎn)PDGF-BB引起的SMC標志基因啟動子活性下降,與Ad-GFP+PDGF-BB組比較,Ad-ILK+PDGF-BB組SM a-actin啟動子活性顯著升高達26.6%(P0.05),Calponin啟動子活性亦上調(diào)達10%(P0.05)。(2)通過ChIP-PCR檢測我們發(fā)現(xiàn),PDGF-BB可顯著減少SMC標志基因SMa-actin及Calponin基因啟動子區(qū)域同SRF的結(jié)合(P0.05),過表達ILK則可明顯逆轉(zhuǎn)PDGF-BB引起的SMC標志基因啟動子同SRF結(jié)合下降,與Ad-GFP+PDGF-BB組比較,Ad-ILK+PDGF-BB組SM a-actin啟動子同SRF結(jié)合的數(shù)量顯著升高達30.1%(P0.05),Calponin啟動子同SRF結(jié)合的數(shù)量亦上調(diào)達29.0%(P0.05)。結(jié)論：1. PDGF-BB短期干預(yù)引起ILK激酶活性下降,導(dǎo)致Elk-I磷酸化增強,競爭性取代Myocardin與SRF的相合,繼而導(dǎo)致Myocardin與SMC標志基因SM 22a啟動子的結(jié)合減少,使SMC收縮標志基因表達下調(diào)。2. PDGF-BB長期干預(yù)引起ILK及Myocardin蛋白表達下調(diào),ILK是維持VSMC分化表型所必須基因之一,ILK過表達阻遏PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC去分化轉(zhuǎn)換,逆轉(zhuǎn)PDGF-BB引起的SMC標志基因啟動子活性下降,并進一步逆轉(zhuǎn)PDGF-BB引起的SMC標志基因啟動子同SRF結(jié)合下降。第三部分地高辛通過上調(diào)ILK信號抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖、遷移和抑制血管損傷后新生內(nèi)膜形成目的：地高辛作為一種經(jīng)典的強心苷類藥物,在治療充血性心力衰竭方面占有重要地位。新近的研究表明,地高辛尚參與多種病理和生理過程,并可通過抗增殖、促凋亡等作用對多種腫瘤細胞發(fā)揮抑瘤作用。我們既往的研究首次證實地高辛通過降低CDK4(Cyclin-Dependent Kinases 4)、CDK6蛋白的表達水平,上調(diào)p27kip1蛋白的表達,阻止細胞進入分裂期來抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖。本部分進一步評價地高辛是否通過上調(diào)ILK信號抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖、遷移和抑制血管損傷后新生內(nèi)膜形成。方法：(1)體外實驗部分：通過MTT(Methyl Thiazolyl Tetrazolium)法評價VSMC增殖水平的變化,細胞遷移研究采用Transwell進行,實時熒光定量PCR及Western blot評價地高辛對PDGF-BB誘導(dǎo)SMC表型標志基因SM-α-actin、calponin和SM 22a mRNA及蛋白水平變化的影響,(2)體內(nèi)實驗部分：通過頸動脈球囊損傷建立大鼠RS模型,評價地高辛是否可在體抑制VSMC增殖并抑制新生內(nèi)膜形成。結(jié)果：本部分研究表明,地高辛通過下調(diào)CDK活性和恢復(fù)p27kip1水平抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖；地高辛恢復(fù)PDGF-BB誘導(dǎo)的ILK表達下降并阻止PDGF-BB誘導(dǎo)的GSK 3β活性上調(diào)；進一步發(fā)現(xiàn)地高辛顯著抑制基質(zhì)金屬蛋白酶家族(Matrix metallopeptidase,MMPs)表達；最后,地高辛明顯抑制體內(nèi)VSMC的增殖并抑制RS中新生內(nèi)膜的形成。結(jié)論：地高辛抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)換,并抑制RS后新生內(nèi)膜形成,其機制部分是通過上調(diào)ILK信號通路完成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R541.4
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本文編號：1956252