本文選題：Krüppel樣因子15 + 心肌纖維化　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景與目的:心臟瓣膜疾病在成人心臟疾病中占很大比重,是造成心力衰竭的主要病因之一。慢性主動脈瓣狹窄是臨床常見的導(dǎo)致左心室超負(fù)荷的疾病,通過主動脈瓣膜置換解除流出道梗阻是典型的卸負(fù)荷過程。理論上瓣膜置換術(shù)后左心室壓力負(fù)荷解除,臨床癥狀應(yīng)改善徹底,但部分患者心功能仍不能有效恢復(fù),癥狀緩解不明顯,甚或有加重趨勢,并不能使患者受益。具體原因尚不明確,是否與心肌纖維化程度有關(guān)?壓力超負(fù)荷/卸負(fù)荷后心肌重塑決定心功能的恢復(fù)。心肌重塑是指在各種機(jī)械應(yīng)力、代謝和遺傳的因素作用下產(chǎn)生的以包括心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化、細(xì)胞間基質(zhì)成分增加和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變等為特征的病理生理過程。早期心肌肥厚是壓力超負(fù)荷作用下產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng),它主要發(fā)生在長期壓力超負(fù)荷的情況下,心肌總量增加,收縮力增強(qiáng),是一種有效的代償方式。然而,這種代償能力是有限的,當(dāng)肥大心肌的需氧量得不到滿足時,心肌間質(zhì)纖維化加重,最終導(dǎo)致心肌收縮功能障礙。在真核生物中,KLFs家族是基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(BTEBP)中的一大類,它們參與早期的胚胎生長發(fā)育、細(xì)胞分化、組織器官的形成、原癌基因的突變和血管生成等生理病理過程,是真核生物中最大、最重要的一類基礎(chǔ)調(diào)控因子,這些KLF因子在生物體多種細(xì)胞類型中廣泛表達(dá),發(fā)揮著各自不同的重要作用。既往針對此家族的眾多因子有過廣泛的研究,例如對KLF5基因敲除大鼠的研究顯示該因子在連續(xù)注射血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚、纖維化反應(yīng)過程中是必不可少的;而且,在體外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞中,KLF5基因直接調(diào)控了與組織重塑和傷口愈合有關(guān)的血小板起源的生長因子PDGF-A的轉(zhuǎn)錄;另外,在心肌成纖維細(xì)胞中特異性敲除KLF5基因,減輕了中等強(qiáng)度壓力超負(fù)荷所致心肌肥厚,是心血管重塑中的一個重要調(diào)控因子,在壓力超負(fù)荷心肌纖維化中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。而KLF15是已發(fā)現(xiàn)的17個KLFs家族基礎(chǔ)調(diào)控因子中的重要一員,它在細(xì)胞的生長、分化、凋亡等各個環(huán)節(jié)中起重要作用。綜合以上研究及發(fā)現(xiàn),我們認(rèn)為心肌重塑導(dǎo)致的超微結(jié)構(gòu)改變是影響心臟功能恢復(fù)的主要分子生物學(xué)事件,KLF15又是其中重要的關(guān)鍵因子。本課題擬建立有效的動物及細(xì)胞模型,在此動物和細(xì)胞兩個水平上探尋KLF15在心肌肥厚、纖維化中的具體調(diào)控機(jī)制。研究方法:本課題基于上述問題,采用在體、體外細(xì)胞實驗相結(jié)合的方法進(jìn)行,主要分為以下四個部分:第一部分:采用野生型雄性sd大鼠,鼠齡3-4周,在非人工通氣的條件下,于主動脈瓣上、升主動脈處縮窄,建立了壓力超負(fù)荷心肌肥厚、纖維化動物模型,并在不同時間段解除縮窄制作卸壓力負(fù)荷模型;使用心臟彩色多普勒對該動物模型相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測,以明確造模效果。第二部分:利用大鼠非人工通氣升主動脈縮窄-松解模型,探尋不同時間點(diǎn)超負(fù)荷及完全卸壓力負(fù)荷后心肌病理改變和心肌纖維化轉(zhuǎn)歸特征,探討klf15基因在此過程中的作用,及其與tgf-β、ctgf、mrtf-a間的相互關(guān)系,了解klf15基因在壓力超負(fù)荷所致心肌纖維化的可能機(jī)制。第三部分:進(jìn)行了大鼠心肌成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng),對培養(yǎng)的原代細(xì)胞做出了鑒定以及細(xì)胞增殖、凋亡情況的觀察,并在此基礎(chǔ)之上建立了tgf-β促體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞肥大模型,為心肌肥厚、纖維化發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸的進(jìn)一步具體分子機(jī)制研究提供細(xì)胞實驗平臺。第四部分:在體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)之上,以所構(gòu)建的tgf-β促細(xì)胞肥大模型為平臺,引入干涉和過表達(dá)klf15腺病毒載體并轉(zhuǎn)染,從細(xì)胞水平上探討了心肌纖維化及轉(zhuǎn)歸中的具體分子機(jī)制。研究結(jié)果:主要結(jié)果如下:1、我們利用sd大鼠在非人工通氣的條件下完成了升主動脈的縮窄及松解手術(shù),通過心臟彩色多普勒檢測,從彩超圖像及相關(guān)測定數(shù)據(jù)結(jié)果中了解到:縮窄效果確切,縮窄后升主動脈直徑縮小約50%,橫截面積縮小約75%,縮窄遠(yuǎn)端有較明顯擴(kuò)張,縮窄后左室后壁、室間隔厚度增加明顯,而心臟射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率、左室收縮壓明顯降低,左室舒張末壓明顯增加,而縮窄松解后,升主動脈直徑、心臟射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率、左室收縮壓均有所恢復(fù),室壁及室間隔厚度、左室舒張末壓均有不同程度降低。2、在大鼠非人工通氣升主動脈縮窄及松解動物模型中,主動脈瓣上縮窄后1周,即開始出現(xiàn)左心室肥厚、心肌纖維化,隨縮窄時間延長,肥厚纖維化增加,tgf-β、ctgf、mrtf-a等細(xì)胞因子的mrna及蛋白表達(dá)水平逐漸增加,而klf15因子的mrna及蛋白表達(dá)水平卻逐漸減少;升主動脈縮窄后松解,心臟的各項指標(biāo)(包括心室肥厚情況、心肌纖維化程度等)都有所改善,但早期(1W)、中期(3W)、晚期(6W)縮窄后松解組的恢復(fù)程度有一定差異,越早去縮窄的,各指標(biāo)改善更為顯著。這說明心臟結(jié)構(gòu)、功能的恢復(fù)程度與縮窄的持續(xù)時間有關(guān)。而TGF-β、CTGF、MRTF-A等細(xì)胞因子的mRNA及蛋白表達(dá)水平松解后有逐漸減少趨勢,KLF15因子的變化則相反,越早去縮窄越能更好的恢復(fù)并接近正常。3、通過對所培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光鑒定、增殖及凋亡等生物活性檢測,我們可知該大鼠心肌成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法可靠,操作簡便,細(xì)胞生長良好,純度高,可穩(wěn)定傳代;通過對Ⅰ型膠原mRNA水平的檢測結(jié)果分析,TGF-β確有促心肌成纖維細(xì)胞肥大、纖維化的作用,且效果明顯。4、所構(gòu)建的KLF15過表達(dá)腺病毒及其干擾片段在體外培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞中有較高的轉(zhuǎn)染率,轉(zhuǎn)染效率與作用濃度和時間在一定范圍內(nèi)也呈正相關(guān)。過表達(dá)KLF15腺病毒與心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,KLF15 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著提高,TGF-β、CTGF、MRTF-A的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低,其細(xì)胞肥大、纖維化減輕,Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量減少。而KLF15干擾片段與細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,上述各指標(biāo)變化均與之相反。結(jié)論:1、成功建立大鼠非人工通氣升主動脈縮窄/松解模型,該模型操作簡便,重復(fù)性好,經(jīng)濟(jì),為今后進(jìn)行心肌壓力超負(fù)荷—卸負(fù)荷研究提供了良好的動物實驗平臺;2、在大鼠心肌成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了TGF-β促細(xì)胞肥大模型,為心肌肥厚、纖維化發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸的進(jìn)一步具體分子機(jī)制研究提供了良好的技術(shù)手段和細(xì)胞實驗平臺;3、KLF15可通過反饋調(diào)節(jié)TGF-β,抑制CTGF及MRTF-A的作用,減輕心肌間質(zhì)纖維化及心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變,從而改善心功能,在促心肌肥厚、纖維化中起關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控因子作用。4、KLF15對心肌纖維化作用的可能機(jī)制為:在壓力超負(fù)荷刺激時,心肌成纖維細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力或化學(xué)因素的作用下,TGF-β表達(dá)增加,通過自(旁)分泌的形式作用于成纖維細(xì)胞,活化P38MAPK進(jìn)而抑制KLF15的表達(dá),一方面,低表達(dá)的KLF15失去對心肌成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)的抑制,促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生;另一方面,低表達(dá)KLF15對心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A(MRTF-A)失去競爭性結(jié)合能力,MRTF-A通過SRF促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞,促進(jìn)間質(zhì)纖維化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.2

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