本文選題：糖尿病 + 脂肪��； 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：1研究背景糖尿病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等危癥的概念已深入人心。多項糖尿病防治指南都將糖尿病是心血管事件獨立危險因素、糖尿病患者是心血管疾病的高危人群的觀點納入指南。眾多臨床試驗及薈萃分析結果顯示,糖尿病患者的心血管疾病發(fā)病更早,病變范圍更廣并且程度更重,預后更差。目前的循證醫(yī)學證據(jù)表明,嚴格控制空腹血糖與糖化血紅蛋白可以顯著降低糖尿病微血管并發(fā)癥,但對于糖尿病大血管并發(fā)癥的作用仍存在爭議。強化降糖組死亡率較高的情況,提示血糖和胰島素水平的改變不是導致糖尿病患者急性冠脈綜合征的核心因素。因此,探索血糖因素之外的糖尿病血管損傷因子,對于發(fā)現(xiàn)糖尿病患者心血管并發(fā)癥風險增高的深層次機制、防治糖尿病血管病變有著重要意義。眾多的動物與臨床試驗明確了脂肪組織與心血管病變的密切聯(lián)系�？刂企w重可以緩解脂肪組織功能失調(diào),降低心血管病事件風險。糖尿病患者體內(nèi)的脂肪組織發(fā)生功能失調(diào),表現(xiàn)為慢性、亞臨床狀態(tài)的炎癥狀態(tài)。糖尿病狀態(tài)下失衡的脂肪中發(fā)生慢性炎癥,同時循環(huán)中脂肪相關炎癥因子升高。但是脂肪組織中的脂肪因子如何進入循環(huán),如何被靶細胞攝取發(fā)揮作用的具體機制尚不明確。細胞微囊泡,是指細胞釋放到胞外,大小不一的膜性小泡,其中含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸與脂質(zhì)。廣泛存在于血液、尿液、腹水、支氣管肺泡灌洗液、唾液及母乳等眾多體液中。它能被內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、血小板甚至是腫瘤細胞分泌和攝取,從而介導細胞與細胞、組織與組織間的信號通訊。依據(jù)微囊泡的大小與產(chǎn)生機制不同可以分為外泌體(Exosome,直徑30-100nm)、微粒(Microvesic1e,100-1 000nm)、凋亡小體(Apoptosis body,1-5μm)等。其中Exosome的作用研究最為深入,已有研究發(fā)現(xiàn)Exosome涉及抗腫瘤免疫、腫瘤逃逸、組織修復、神經(jīng)細胞間通信、病原體免疫、胚胎發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控等多種生命與疾病過程。新近的研究發(fā)現(xiàn)Exosome在心血管穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用,研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織內(nèi)的脂肪細胞可以主動分泌Exosome(脂肪組織來源Exosome,adipose derived Exosome,ADE),ADE不僅參與巨噬細胞激活、介導組織纖維化、幫助組織修復,還參與炎癥過程。但是糖尿病狀態(tài)下發(fā)生炎癥的脂肪組織釋放的ADE的具體成分是什么?主要功能是什么?參與哪些生命與疾病過程?這些問題尚不清楚。為探索上述問題,我們提取了正常小鼠、肥胖型糖尿病小鼠(ob/ob小鼠)與非肥胖型糖尿病小鼠(STZ+高脂喂養(yǎng)誘導)的脂肪組織分泌的ADE,以及臨床糖尿病與非糖尿病患者的ADE,運用多種手段檢測其Exosome表征與理化特征,質(zhì)譜分析糖尿病小鼠ADE的蛋白組成,運用生物信息學的方法分析其蛋白功能與參與的生命過程,為進一步探索糖尿病狀態(tài)下脂肪組織分泌的ADE與心血管疾病的關系打下基礎。2研究目的1)探討分離純化ADE的方法與策略;2)分析糖尿病來源ADE的蛋白質(zhì)構成;3)運用生物信息學的方法分析ADE蛋白的功能。3實驗方法1)收集糖尿病與非糖尿病小鼠及人的內(nèi)臟脂肪組織分泌的上清;2)采用差速離心法、密度梯度超速離心法(重水蔗糖墊法)與沉降劑(ExoQuick)方法分離純化ADE;3)通過檢測標志蛋白、標志酶、總蛋白、動態(tài)光散射與電鏡形態(tài)測定上述分離純化方法的得率與純度;4)使用質(zhì)譜分析檢測ADE中蛋白成分;5)比對數(shù)據(jù)庫,分析ADE中Exosome標志蛋白的組成與脂肪因子富集情況;6)使用生物信息學方法分析ADE中蛋白功能;7)Western blotting與ELISA的方法比較非糖尿病與糖尿病個體ADE中富集的脂肪因子,并統(tǒng)計相關的臨床影響因素;8)免疫金標及組分Western blotting分析ADE中脂肪因子的空間定位。4實驗結果1)ADE分離與純化方法的比較(1)得率比較:比較差速離心法、重水蔗糖墊法與沉降劑Exoquick法分離提純的Exosome,結果顯示差速離心法獲得最多的總蛋白、Exosome標志蛋白CD63與標志酶Acetyl-CoA,沉降劑Exoquick法次之,重水蔗糖墊法相對最少;(2)純度比較:以標志酶Acetyl-CoA與總蛋白比率作為純度參數(shù)比較不同方法提取純化的ADE,結果顯示差速離心法獲得的ADE純度最高;同時透射電鏡觀察純化的ADE樣品,發(fā)現(xiàn)差速離心法獲得的ADE背景較低,而沉降劑法獲得的ADE背景中有中高電子密度的顆粒物污染;(3)粒徑大小比較:差速離心法得到Exosome直徑在30-100nm之間,各個批次之間直徑差異較小;重水蔗糖墊法得到的Exosome直徑多為30-120nm,但有部分批次的樣品存在100-400nm的顆粒;沉降劑Exoquick法得到15-130nm的Exosome,但是各批次的直徑差異較大;(4)孵育時間對脂肪細胞釋放ADE數(shù)量的影響:比較孵育脂肪組織15rnin、30min、60min,2h,3h與6h后差速離心法分離提取的ADE,結果顯示孵育6h能穩(wěn)定獲得最多的總蛋白、Exosome標志蛋白CD63與標志酶Acetyl-CoA;(5)孵育時間對脂肪細胞釋放ADE純度的影響:結果顯示孵育6h獲得的ADE中Acetyl-CoA 與總蛋白比率與孵育 15min、30nin、60min,2h,3h 得到 ADE 無顯著差異;2)糖尿病ADE蛋白成分的分析(1)糖尿病ADE蛋白質(zhì)譜結果:獲得34901個肽段,比對數(shù)據(jù)庫,閾值設定為p0.00575,ADE中鑒定出1331種蛋白;比對Exosome特征蛋白數(shù)據(jù)庫ExoCarta—Top 100 protein,ADE 中含有 87 種 Exosome 特征蛋白,僅未檢測到 VCP,HSPA5,SLC3A2,CCT2,TUBA1B,ANXA6,TUBA1C,TFRC,HIST2H4A,ITGA6,HIST1H4B,YWHAH等13個曾報道過的特征蛋白;(2)糖尿病ADE蛋白中脂肪因子的種類:ADE中鑒定到Dipeptidyl peptidase 4,Retinol-binding protein,Resisitin,Pigment epithelium derived factor,Adiponectin五種脂肪因子,其中DPP4肽段匹配最多,總匹配數(shù)位49,重點匹配為23。(3)糖尿病ADE蛋白功能聚類:使用David對鑒定的蛋白進行功能聚類,結果顯示 ADE 中的蛋白主要功能為 Tricarboxylic acid cycle,Proteasome core complex,GTP binding,Oxidoreductase activity,Annexin,Contractile fiber,Protein import into nucleus,Regulation of T cell mediated cytotoxicity,Neutral lipid metabolic process,Nucleoside binding,Positive regulation of adaptive immune response,Glycogen metabolic process,Mitochondrial respiratory chain complex I,Nicotinamide nucleotide metabolic process,Lipoic acid binding,ATP synthesis coupled proton transport(P0.007)。(4)糖尿病ADE蛋白Pathway聚類:主要涉及蛋白結合、核酸結合與鈣離子通道等功能。(5)非糖尿病與糖尿病的小鼠(WTvs.ob/ob和WTvs.STZ-WT),人(無vs.合并糖尿病的患者)的內(nèi)臟脂肪ADE中DPP4含量比較:與WT小鼠相比,ob/ob小鼠的ADE中DPP4明顯升高。為了明確DPP4在其他糖尿病小鼠模型ADE中的表達情況,排除瘦素基因的影響,我們構建了 STZ誘導的糖尿病小鼠模型。與WT小鼠相比,STZ誘導的WT小鼠ADE中DPP4同樣明顯升高。(6)為了探索其臨床相關性,我們收集了 19例人體大網(wǎng)膜內(nèi)臟脂肪組織(9例糖尿病,10例正常對照),使用上述方法分離純化得到人源ADE。ELISA結果顯示糖尿病患者ADE中DPP4明顯高于正常對照。(7)ADE中DPP4與脂肪細胞大小,空腹血糖的關系:為探索影響ADE中DPP4含量的臨床因素,我們采集了上述19例研究對象的臨床及實驗室檢查資料,其中脂肪細胞大小(r=0.60,P0.01),空腹血糖(r=0.50,p0.01)與ADE中DPP4的含量成正相關關系。而ADE中DPP4含量與性別、年齡、體重、吸煙史、飲酒史、冠心病史、高血壓史、糖尿病史、糖尿病病程、TC、TG、HDL-C和LDL-C無明顯線性關系。(8)糖尿病ADE膜組分與內(nèi)含物組分中DPP4含量比較:DPP4可裂解為胞內(nèi)-跨膜段與胞外段兩部分。胞外段為DPP4可溶的形式,可以直接釋放到體液中,為明確ADE中DPP4的具體存在形式,我們聯(lián)合堿與超聲方法破碎ADE,并分離ADE膜組分與內(nèi)含物組分,Western blotting檢測兩者中DPP4含量。結果顯示內(nèi)含物組分中不含DPP4。(9)糖尿病ADE DPP4原位金標電鏡觀察:為了在原位顯示DPP4在ADE的表達,我們使用免疫金標ob/ob ADE,電鏡結果顯示,對照ADE無金顆粒結合,而DPP4抗體標記組的ADE膜表面有明顯的金顆粒結合。5結論1)差速離心法是穩(wěn)定獲得高純度與高得率ADE的合適方法;2)糖尿病ADE中富集DPP4等脂肪因子,其含量與空腹血糖水平和脂肪細胞大小成正相關關系;3)糖尿病ADE負載的蛋白可能參與能量代謝、物質(zhì)合成、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學過程。1研究背景眾多的心血管疾病危險因素中,糖尿病可以獨立增加心血管疾病風險4倍。糖尿病是以血糖升高為主要特征的慢性代謝性疾病,為此眾多學者開展了許多臨床試驗,觀察降糖治療是否能有效降低糖尿病患者的心血管疾病風險,但是這些臨床試驗的結果仍存在巨大爭議。減少糖尿病患者的心血管事件,最直接有效的治療方法是心臟的再血管化。但是,無論是微創(chuàng)的經(jīng)皮冠狀動脈介入術還是開胸的冠狀動脈旁路移植術,都面臨術后再狹窄的嚴峻挑戰(zhàn)。血管再狹窄最主要的病理表現(xiàn)是原有內(nèi)皮損傷后血管平滑肌細胞在病理刺激下異常增殖并遷移至內(nèi)膜下形成新生內(nèi)膜,導致內(nèi)膜肥厚,影響血流灌注形成再狹窄。藥物涂層支架表面的雷帕霉素及紫杉醇等抑制增殖的藥物在可以有效抑制平滑肌細胞增殖與遷移。藥物涂層支架的廣泛應用似乎為預防糖尿病術后再狹窄帶來了曙光。遺憾的是,新的臨床數(shù)據(jù)顯示,即便是應用了藥物涂層支架,糖尿病仍然是術后再狹窄最重要的獨立危險因素。因此,深入研究糖尿病患者血管再狹窄及內(nèi)膜新生的發(fā)生機制和干預靶點,對于改善糖尿病患者心血管預后具有重要的理論和實際意義。近年來的研究結果表明糖尿病狀態(tài)下脂肪組織存在不斷進展的慢性炎癥,并不斷向周圍與血液中分泌具有炎性作用的脂肪因子。有學者認為心血管疾病與2型糖尿病同屬于慢性的、亞臨床的炎癥性疾病。血液循環(huán)中具有炎性作用的脂肪因子與糖尿病患者術后再狹窄發(fā)生率密切相關。但是近年來的針對脂肪因子的治療似乎都未取得預期的效果。所以,開發(fā)阻斷脂肪因子產(chǎn)生、運輸和結合的治療措施對于防治糖尿病患者術后再狹窄有著重要意義。有學者發(fā)現(xiàn)脂肪組織分泌的Exosome樣囊性小泡能攜帶脂肪因子,介導巨噬細胞激活,促進炎癥并導致胰島素抵抗。Exosome是一種細胞分泌至胞外的,大小不一的膜性小囊泡(直徑30-100nm)。Exosome內(nèi)的蛋白或核酸成分參與細胞間、細胞內(nèi)信號傳導,介導表觀遺傳學調(diào)控、代謝記憶、血管新生、脂質(zhì)代謝與免疫等過程。但是脂肪組織來源的Exosome(Adipose derived Exosome,ADE)在內(nèi)膜新生與血管再狹窄中的作用及其對血管平滑肌增殖與遷移能力的影響尚未見報道。二肽基肽酶4(DPP4),是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子,可以以旁分泌與自分泌的形式參與胰島素抵抗的發(fā)生。因為存在可溶性的DPP4,在血漿和其他體液中都可以檢測到DPP4的活性。DPP4的抑制劑常與二甲雙胍聯(lián)用作為2型糖尿病的二線治療。我們在論文I中的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病個體內(nèi)ADE富含DPP4分子,但是對于ADE中DPP4對糖尿病患者內(nèi)膜新生中的作用及機制還不清楚。2研究目的:1)探索糖尿病來源ADE對血管內(nèi)膜新生的作用;2)明確ADE中DPP4分子對血管平滑肌細胞增殖與遷移功能,以及血管內(nèi)膜新生的作用;3)探索ADE對血管內(nèi)膜新生的具體分子機制。3研究方法:1)實驗模型構建:小鼠頸動脈內(nèi)膜拉傷構建血管內(nèi)膜新生模型;2)細胞模型:提取各基因型小鼠的原代主動脈血管平滑肌細胞,使用3-5代細胞進行實驗;3)ADE對內(nèi)膜新生的作用:血管內(nèi)膜新生模型小鼠尾靜脈注射提取的非糖尿病與糖尿病來源的ADE;4)ADE對血管平滑肌細胞增殖與遷移的作用:加入不同來源的ADE后通過劃痕實驗、Transwell實驗與Ki67免疫熒光觀察平滑肌細胞的遷移與增殖功能;5)PKH26熒光染料標記ADE進行體內(nèi)外示蹤實驗研究ADE在體內(nèi)外的攝取情況;6)ADE中DPP4對血管內(nèi)膜新生的影響:鹽酸西格列汀與和艾塞那肽處理尾靜脈注射糖尿病來源ADE的血管內(nèi)膜新生模型小鼠,觀察DPP4抑制劑與GLP1類似物對ADE刺激內(nèi)膜新生的影響;7)Western blotting檢測ADE刺激下小鼠內(nèi)膜新生的血管中的ERK1/2、與NF-κB信號通路的變化;8)體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中加入ERK1/2與NF-κB抑制劑,觀察ERK1/2與NF-κB通路在糖尿病ADE刺激的血管內(nèi)膜新生中的作用;9)IPGTT、IPITT、血脂血糖功能與基本生理指標的測定,觀察ADE對小鼠糖脂代謝與基本生理功能的影響。4研究結果:1)ADE對血管損傷后內(nèi)膜新生的影響(1)非糖尿病(WTADE)與糖尿病來源的ADE(ob/obADE)對血管損傷后內(nèi)膜新生面積與比率的影響:與對照組相比,WTADE刺激組損傷的頸動脈管腔面積、新生內(nèi)膜面積和新生的內(nèi)膜/中膜厚度的差異無統(tǒng)計學意義,僅中膜較對照組增厚。而ob/ob ADE刺激組較對照組頸動脈管腔面積明顯縮小、新生內(nèi)膜面積顯著擴大,新生的內(nèi)膜/中膜厚度升高。(2)非糖尿病與糖尿病來源的ADE對血管損傷后新生內(nèi)膜內(nèi)平滑肌細胞增殖的影響:Ki67陽性占中內(nèi)膜有核細胞比率近似等于新生內(nèi)膜平滑肌增殖細胞比率。結果顯示假手術組,對照組,WT ADE刺激組的損傷血管中增殖細胞較少,皆3%,而ob/ob ADE刺激組的損傷血管中增殖細胞較前三組明顯增加(11.0±0.51%)。(3)非糖尿病與糖尿病來源的ADE對小鼠糖脂代謝等代謝指標的影響:與假手術組相比,BSA對照組,WTADE組,ob/obADE組體重,日常食物攝入,飲水攝入,收縮壓,舒張壓,心率,空腹血糖,空腹胰島素,TG,TC,HDL-C,LDL-C差異無統(tǒng)計學意義。2)非糖尿病與糖尿病來源的ADE對原代血管平滑肌細胞增殖與遷移功能的影響:(1)原代小鼠主動脈平滑肌的鑒定:每個爬片隨機選取10個視野,計算αSMA陽性細胞占總細胞數(shù)的比率。提取的各批次細胞陽性率為95.2～98.5%。(2)非糖尿病與糖尿病來源的ADE對原代血管平滑肌細胞增殖功能的影響:Ki67陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)近似等于血管平滑肌細胞增殖率。對照組(5.6±0.4%)、BSA 組(5.1±0.12%)與 WT ADE(6.0±0.35%)組三組的增殖細胞陽性率差異無統(tǒng)計學意義,而ob/ob ADE刺激組增殖細胞陽性率較前三組明顯升高(15.3±4.2%)。(3)非糖尿病與糖尿病來源的ADE對原代血管平滑肌細胞遷移功能的影響:在Scratch wound實驗中,與BSA組相比,WT ADE刺激下的平滑肌遷移率并無明顯變化,而ob/ob ADE刺激后平滑肌遷移率明顯提高。Transwell實驗的結果顯示與其他三組相比ob/ob ADE刺激后遷移至下室的平滑肌數(shù)量明顯增多。3)鹽酸西格列汀與和艾塞那肽對ob/ob ADE誘發(fā)的內(nèi)膜新生的影響(1)鹽酸西格列汀與和艾塞那肽對ob/ob ADE誘發(fā)的內(nèi)膜新生面積與比率影響:在體內(nèi)實驗中,內(nèi)膜損傷并按上述方法注射ob/ob ADE刺激的小鼠給予鹽酸西格列汀與和艾塞那肽處理,結果顯示鹽酸西格列汀與載體組相比能顯著減少新生內(nèi)膜/中膜比率。而艾塞那肽處理與載體組相比,新生內(nèi)膜/中膜比率差異無統(tǒng)計學意義。(2)鹽酸西格列汀與和艾塞那肽對ob/ob ADE誘發(fā)的新生內(nèi)膜中平滑肌增殖的影響:在體內(nèi)實驗中,鹽酸西格列汀能顯著降低ob/ob ADE處理下的平滑肌增殖率。而艾塞那肽處理與載體組相比,平滑肌增殖比率無明顯差異。(3)鹽酸西格列汀與和艾塞那肽對ob/ob ADE處理小鼠胰島素敏感性的影響:在IPGTT與IPITT實驗中,艾塞那肽明顯提高了 ob/ob ADE處理小鼠胰島素敏感性。但未觀察到鹽酸西格列汀對ob/ob ADE處理小鼠胰島素敏感性有明顯影響。(4)鹽酸西格列汀與和艾塞那肽對ob/ob ADE刺激的血管平滑肌細胞增殖功能影響:在體外實驗中,鹽酸西格列汀能顯著降低ob/ob ADE處理下的平滑肌增殖率。而艾塞那肽處理與載體組相比,平滑肌增殖比率無明顯差異。(5)鹽酸西格列汀與和艾塞那肽對ob/ob ADE刺激的血管平滑肌細胞遷移功能的影響:在Scratch wound實驗中,與載體組相比,艾塞那肽對ob/ob ADE刺激下的平滑肌遷移率并無明顯影響,而鹽酸西格列汀能明顯降低ob/ob ADE刺激下平滑肌遷移率。Transwell實驗的結果顯示艾塞那肽對ob/ob ADE刺激下的下室遷移的平滑肌數(shù)目并無明顯影響,而鹽酸西格列汀組明顯減少ob/ob ADE刺激下遷移至下室的平滑肌數(shù)量。4)TLR4-ERK1/2/NF-KB信號通路在ADE誘導的內(nèi)膜新生及平滑肌細胞增殖與遷移中作用(1)ADE對新生內(nèi)膜中ERK1/2/NF-κB信號通路的影響我們使用了 Western blotting檢測了 WT ADE與ob/ob ADE刺激的損傷的右側頸動脈中蛋白p65(Ser536位點)與ERK1/2(Thr202/Tyr204位點)的磷酸化情況,結果證明ob/ob ADE刺激下血管中p65(Ser536位點)與ERK1/2(Thr202/Tyr204位點)磷酸化較WT ADE刺激組明顯升高。(2)TLR4在ADE誘導的內(nèi)膜新生的作用TLR4是ERK1/2/NF-κB信號通路的共同上游,也是最關鍵的模式受體之一。有文獻報道TLR4對于Exosome的內(nèi)化及信號傳導具有關鍵作用。于是我們使用TLR4 KO小鼠探討其在ob/ob ADE刺激的內(nèi)膜新生中的作用,結果顯示與WT小鼠相比較,TLR4 KO能顯著降低內(nèi)膜增生的比率與增殖細胞比率。(3)P65磷酸化抑制劑Caffeic acid phenethyl ester對ob/ob ADE培養(yǎng)的原代血管平滑肌細胞增殖與遷移功能的影響Caffeic acid phenethyl ester是常用的P65磷酸化抑制劑,經(jīng)過我們實驗驗證,Caffeic acid phenethyl ester在150μM的濃度的時候就能達到明顯的抑制效果。此濃度下,Caffeic acid phenethyl ester能明顯減少ob/ob ADE刺激下的平滑肌細胞增殖與遷移。(4)ERK1/2磷酸化抑制劑FR180604對ob/ob ADE培養(yǎng)的原代血管平滑肌細胞增殖與遷移功能的影響ERK1/2磷酸化抑制劑FR180604在10μM濃度下能明顯抑制ERK1/2 Thr202/Tyr204位點磷酸化,且能明顯減少ob/ob ADE刺激下的平滑肌細胞增殖。Scratch wound實驗與Transwell實驗也明確10μM的FR180604降低ob/ob ADE刺激下的平滑肌細胞的遷移能力。5研究結論1)糖尿病ADE中含有更多的DPP4,可通過TLR4-NF-κB/ERK1/2途徑顯著增強血管平滑肌細胞增殖與遷移能力,加劇血管內(nèi)膜新生;2)DPP4抑制劑等降糖藥能顯著減緩糖尿病ADE加劇的血管內(nèi)膜新生,GLP1類似物無顯著作用;3)聯(lián)系炎癥脂肪與受損血管的ADE可能成為治療糖尿病心血管病變的新靶點。1研究背景糖尿病大血管病變是糖尿病嚴重并發(fā)癥——冠心病、腦卒中及周圍血管疾病的共同病理基礎。脂肪組織作為重要的內(nèi)分泌與旁分泌器官影響糖尿病及其大血管并發(fā)癥。近來的研究發(fā)現(xiàn)與血管位置最為接近的管周脂肪(Perivascular adipose tissue,PVAT)與動脈粥樣硬化等糖尿病大血管并發(fā)癥關系密切。Framingham和Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis研究發(fā)現(xiàn)心外膜PVAT的體積是心血管與動脈粥樣硬化疾病的獨立危險因素。所以有學者提出PVAT體積增加代表的血管"局部肥胖"可能與糖尿病或代謝綜合征相關的動脈粥樣硬化疾病聯(lián)系更為密切。隨后的研究證實了"局部肥胖"的PVAT出現(xiàn)脂肪局部炎癥與脂肪因子的增多。并且這些局部脂肪因子的變化相對循環(huán)中各種血漿生物標志物更能反映冠脈疾病嚴重程度。但是PVAT在糖尿病中如何發(fā)生"局部肥胖",這些脂肪因子是如何產(chǎn)生并穿越血管壁影響血管結構與功能的機制仍然不清楚。巨噬細胞極化是脂肪炎癥的關鍵環(huán)節(jié),在代謝紊亂的糖尿病患者脂肪組織中,極化的巨噬細胞使得脂肪細胞功能發(fā)生障礙,而功能障礙的脂肪細胞釋放出來的炎癥介質(zhì)進一步趨化或激活巨噬細胞,脂肪細胞與巨噬細胞相互作用引發(fā)炎癥反應的惡性循環(huán)。未活化的巨噬細胞一般稱為M0型巨噬細胞,而活化的巨噬細胞大體上可以分為兩種亞型,Ml型巨噬細胞具有分泌大量促炎細胞因子的功能;M2型巨噬細胞分泌包括IL-10等抑制炎癥的細胞因子,M1/M2巨噬細胞失衡是誘導脂肪組織炎癥的主要因素。過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptors γγ,PPARγ)是調(diào)節(jié)脂肪重構與巨噬細胞極化的重要轉錄因子。PPARy可以通過激活轉錄多種基因參與調(diào)解脂肪細胞與巨噬細胞功能。臨床研究也發(fā)現(xiàn)服用PPARγ激活劑——噻唑烷二酮類藥物的糖尿病患者內(nèi)臟脂肪組織中M2細胞數(shù)目上升,M1/M2比率降低。但是管周脂肪及其中的巨噬細胞的變化與PPARγ的調(diào)控機制仍不清楚。TRB3是糖尿病糖脂代謝與巨噬細胞功能重要的調(diào)節(jié)蛋白,之前的研究發(fā)現(xiàn)TRB3參與糖尿病中巨噬細胞的凋亡,在TRB3基因沉默后,斑塊內(nèi)的巨噬細胞凋亡減少,炎癥因子表達減少。同時也有研究發(fā)現(xiàn)TRB3參與調(diào)解糖尿病脂肪細胞的功能紊亂,過表達TRB3可以顯著抑制PPARγ的轉錄活性。但是TRB3/PPARγ途徑在巨噬細胞與脂肪炎癥方面在作用尚未見報道。綜合上述研究,"局部肥胖"的PVAT發(fā)生炎癥,巨噬細胞極化是脂肪炎癥的關鍵因素,并且與糖尿病動脈粥樣硬化密切相關。TRB3基因在糖尿病疾病中表達顯著升高,并且與PVAT炎癥中兩種重要細胞——脂肪細胞和巨噬細胞功能調(diào)控密切相關。其下游PPARy可能參與調(diào)節(jié)脂肪功能與巨噬細胞炎癥。但是糖尿病中PVAT的巨噬細胞極化的機制尚不明確,TRB3/PPARγ通路在管周脂肪脂肪炎癥中的作用仍不清楚。為探索上述問題,我們建立了糖尿病小鼠頸動脈周圍脂肪移植模型,通過極化的巨噬細胞過繼免疫糖尿病小鼠,局部沉默TRB3基因、PPARy激動劑干預的方法研究TRB3/PPARγ途徑在PVAT巨噬細胞極化和動脈粥樣硬化斑塊過程中的作用及機制,為進一步探索糖尿病狀態(tài)下管周脂肪與相關血管病變的關系奠定基礎。2研究目的1)通過建立糖尿病管周脂肪移植模型,探討糖尿病狀態(tài)下管周脂肪炎癥與動脈粥樣硬化斑塊的關系;2)通過體外誘導極化的巨噬細胞過繼免疫糖尿病動脈粥樣硬化模型小鼠,明確巨噬細胞極化對管周脂肪炎癥與斑塊易損性的影響;3)通過給予PPARγ激活劑和管周脂肪局部沉默TRB3,明確TRB3-PPARγ通路在巨噬細胞極化介導的管周脂肪炎癥與斑塊形成中的作用。3研究方法1)在糖尿病動脈粥樣硬化模型小鼠的基礎上構建頸動脈管周脂肪移植模型;2)檢測頸動脈管周脂肪移植對整體糖脂代謝、胰島素抵抗、脂肪含量與能量代謝的影響;3)超聲與病理方法檢測管周脂肪移植后頸動脈動脈粥樣硬化形成與血管重構情況;4)體外誘導極化的巨噬細胞過繼免疫糖尿病管周脂肪移植小鼠,檢測管周脂肪巨噬細胞炎癥情況及動脈粥樣硬化斑塊負荷與易損性;5)給予模型小鼠PPARγ激動劑吡格列酮處理,檢測管周脂肪巨噬細胞炎癥情況及動脈粥樣硬化斑塊負荷與易損性;6)超聲引導下管周脂肪局部注射TRB3-shRNA病毒載體,檢測管周脂肪巨噬細胞炎癥情況及動脈粥樣硬化斑塊負荷與易損性。4研究結果1)糖尿病管周脂肪移植模型的建立:移植后的管周脂肪無液化壞死,內(nèi)部存在新生血管與神經(jīng)纖維標志物;2)管周脂肪移植對對照飲食和糖尿病小鼠的整體糖脂代謝、整體脂肪含量與整體代謝率無顯著影響;3)管周脂肪移植不增加對照飲食小鼠頸動脈斑塊負荷,但在糖尿病小鼠中,管周脂肪隨病程進展增加頸動脈斑塊負荷與血管重構指標(中內(nèi)膜厚度IMT與脈搏波傳播速度PWV);4)糖尿病頸動脈管周脂肪移植增加頸動脈斑塊負荷與易損性,并且加重管周脂肪炎癥與Ml細胞極化;5)體外誘導極化的Ml巨噬細胞過繼免疫糖尿病管周脂肪移植小鼠,增加頸動脈斑塊負荷與易損性,并且加重管周脂肪炎癥與Ml細胞極化、M2巨噬細胞過繼免疫則減輕頸動脈斑塊負荷與易損性,抑制管周脂肪炎癥,升高M2細胞的比率;6)PPARy激動劑吡格列酮處理糖尿病小鼠,在減輕整體斑塊負荷的同時,可以顯著減輕管周脂肪移植加重的頸動脈斑塊負荷與易損性,并且抑制管周脂肪炎癥,升高M2巨噬細胞比率;7)局部抑制管周脂肪TRB3的表達可以減輕管周脂肪移植加重的頸動脈斑塊負荷與易損性,緩解管周脂肪炎癥,促進巨噬細胞向M2方向轉化;8)免疫共沉淀實驗證實TRB3與PPARγ存在蛋白質(zhì)相互作用。5研究結論1)糖尿病下管周脂肪內(nèi)TRB3表達升高,負性調(diào)控PPARy活性;2)糖尿病促進管周脂肪內(nèi)巨噬細胞向Ml方向極化,加重管周脂肪與相鄰血管內(nèi)炎癥;3)TRB3沉默與PPARγ激動劑能顯著抑制Ml巨噬細胞極化介導的管周脂肪炎癥,減輕斑塊負荷并穩(wěn)定斑塊。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R54
，

本文編號：1919224