本文選題：Sema4D + 心力衰竭�。� 參考：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：Sema4D是軸突導(dǎo)向分子Semaphorin家族成員,又被稱為CD100,其作用除了調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突導(dǎo)向、血管新生、腫瘤轉(zhuǎn)移外,在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮了重要作用。Sema4D是一個分子量150kD的跨膜蛋白,在免疫細(xì)胞和血小板中表達(dá),目前對Sema4D的研究主要集中在其生理作用,其在病理過程中的作用和機(jī)制越來越受到重視。我們實(shí)驗(yàn)室的前期結(jié)果表明Sema4D在血栓形成和心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用,我們擬對其在其他心血管疾病如心衰和肥胖相關(guān)疾病中的作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。目的:1研究Sema4D在心衰病人血漿中的水平和來源心力衰竭是各種嚴(yán)重心臟疾病的共同通路,死亡率與惡性腫瘤相仿,目前對于心力衰竭的治療方法非常有限,同時也需要一些簡便易行的診斷方法。免疫反應(yīng)在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,有些炎癥因子可以作為心衰的診斷指標(biāo),如腫瘤壞死因子(TNF)等。Sema4D是表達(dá)在T細(xì)胞、血小板等表面的跨膜蛋白,具有活化T細(xì)胞和血小板的功能,在活化過程中可以被切割釋放出有活性的可溶性片段。因此我們推測Sema4D可能會參與心力衰竭過程,并且可以作為生物標(biāo)志物用于心力衰竭的診斷,為了證明這一假設(shè),我們將利用臨床樣本,(1)測定心衰病人血漿中可溶性Sema4D的水平;(2)研究Sema4D表達(dá)水平與心衰患者疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系,探討其在心衰患者的診斷和疾病程度評估中的意義;(3)并初步探討心衰患者血漿Sema4D高表達(dá)的細(xì)胞機(jī)制。2研究Sema4D在肥胖和脂肪肝中的作用和機(jī)制肥胖是2型糖尿病和許多心血管疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素,而脂肪組織的長期慢性炎癥反應(yīng)是肥胖誘導(dǎo)相關(guān)疾病的重要原因。由于Sema4D在免疫細(xì)胞中的作用,我們推測Sema4D可能會通過活化T細(xì)胞等促進(jìn)脂肪炎癥;同時由于Sema4D可以通過其受體PlexinB1調(diào)節(jié)Rho的活性,而Rho通路對于脂肪分化有重要調(diào)節(jié)作用,Sema4D也可能通過PlexinB1影響脂肪分化,參與肥胖相關(guān)疾病。為了證明我們的假說,我們利用基因工程小鼠以及高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝模型,(1)研究sema4d及其受體plexinb1在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝中的作用;(2)初步探究sema4d和plexinb1調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝的分子機(jī)制。方法:1建立可溶性sema4d的elisa檢測方法,檢測正常人和心衰病人外周血中sema4d的水平⑴可溶性sema4d的elisa檢測方法的建立擴(kuò)增含有his標(biāo)簽標(biāo)記的sema4d的細(xì)胞外段的psectag2b質(zhì)粒,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,利用親和層析法分離純化上清中的sema4d蛋白,作為標(biāo)準(zhǔn)品。以可溶性sema4d蛋白作為抗原免疫小鼠,制備10株單克隆抗體,從中篩選兩株分別作為包被抗體和檢測抗體,檢測抗體標(biāo)記hrp。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立夾心elisa方法。⑵正常人和心衰病人外周血中sema4d水平檢測收集126位正常人的edta抗凝外周血,離心取血漿。elisa方法測定血漿中可溶性sema4d的水平,分析不同性別和年齡的正常人外周血中sema4d的差異。通過流式細(xì)胞術(shù)和westernblot分析17β雌二醇對jurkat細(xì)胞和血小板表面sema4d表達(dá)的影響。收集157例心衰病人的edta抗凝外周血,離心取血漿,統(tǒng)計(jì)這些病人的基本資料包括年齡、性別、并發(fā)癥等。用建立的elisa方法檢測病人血漿中sema4d的表達(dá),比較心衰病人和正常人血漿sema4d水平及其與年齡和性別的關(guān)系,并分析不同并發(fā)癥如糖尿病或者高血壓對心衰病人血漿中sema4d表達(dá)的影響。2心衰病人外周血t細(xì)胞、b細(xì)胞、血小板表面sema4d的表達(dá)。(1)通過ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離心衰病人(hf)和正常人(hd)外周血淋巴細(xì)胞,分別用cd3和cd19的抗體標(biāo)記t細(xì)胞和b細(xì)胞,同時孵育sema4d抗體,流式分析t細(xì)胞和b細(xì)胞表面sema4d的表達(dá)情況。(2)流式檢測心衰病人和正常人外周血中cd4+t細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞表面sema4d的表達(dá)。(3)通過同時孵育sema4d和cd41抗體,流式檢測正常人和心衰病人血小板表面sema4d的表達(dá)。3檢測sema4d敲除對高脂誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝的影響(1)收集2型糖尿病病人和正常對照的外周血漿,elisa方法檢測血漿中可溶性sema4d的表達(dá)水平;取正常飲食(chowdiet)和高脂飲食(hfd)的小鼠,取內(nèi)臟脂肪組織提取rna,逆轉(zhuǎn)錄成cdna,實(shí)時定量pcr檢測sema4d及其受體plexinb1、plexinb2和cd72的表達(dá)。(2)每5-7天稱量高脂飲食喂養(yǎng)(8-10周)的wt和sema4d-/-小鼠體重,觀測小鼠的體重變化,同時檢測高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的脂肪含量以及血脂變化,以及葡萄糖耐受性。(3)取分別高脂喂養(yǎng)8周和16周的wt和sema4d-/-小鼠肝臟,稱量,肝臟冷凍包埋盒石蠟包埋后切片,分別油紅o染色和he染色,顯微鏡下觀察和拍照,分析脂肪肝的嚴(yán)重程度。(4)取高脂飲食喂養(yǎng)8-10周的wt和sema4d-/-小鼠,分離生殖器脂肪組織細(xì)胞后,流式細(xì)胞分析兩組小鼠脂肪組織中炎癥細(xì)胞的浸潤,包括cd45+細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、f4/80+巨噬細(xì)胞、cd11+m1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量和比例的變化。4體外觀察sema4d對脂肪分化的影響取6-8周小鼠,分離脂肪組織,膠原酶消化后離心去除上層脂肪細(xì)胞,下層基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)3代后,流式檢測間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物的表達(dá),并轉(zhuǎn)染對照和表達(dá)sema4d細(xì)胞外段的質(zhì)粒,加入脂肪分化誘導(dǎo)劑,分化7天后油紅o染色觀察sema4d對脂肪分化的影響。5研究plexinb1敲除對高脂誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝的影響取wt和plexinb1-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)8-10周,觀察小鼠的體重變化,脂肪含量,肝臟冷凍包埋后油紅o染色觀察脂肪肝的嚴(yán)重程度。結(jié)果:1測定并分析正常人和心衰病人外周血中sema4d的含量(1)可溶性sema4d含量檢測的elisa方法的建立為了測定心衰病人sema4d的表達(dá),我們首先建立了夾心elisa方法。我們首先擴(kuò)增了含有his標(biāo)簽標(biāo)記的sema4d的胞外段psectag2b質(zhì)粒,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染罰轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞,用親和層析法分離純化上清中的sema4d蛋白,sds-page電泳結(jié)果顯示其分子量在120kd作用,該蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。并以該蛋白作為抗原免疫小鼠,制備了10株單克隆抗體,從這10株單克隆抗體中篩選了兩株分別作為包被抗體和檢測抗體,檢測抗體標(biāo)記hrp。并以該蛋白作為抗原免疫小鼠,制備了10株單克隆抗體,從中篩選兩株分別作為包被抗體和檢測抗體,檢測抗體標(biāo)記hrp,建立夾心elisa方法。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立夾心elisa方法,并得到了很好的標(biāo)準(zhǔn)曲線(r2=0.996)。(2)心衰病人特別是合并糖尿病的心衰病人血漿中sema4d水平顯著增我們收集了126位正常人的edta抗凝外周血,離心取血漿。通過elisa方法測定可溶性sema4d的表達(dá)。結(jié)果顯示,不同年齡組sema4d表達(dá)沒有顯著差異,但正常男性(5.15±3.30ng/ml,n=63)較正常女性(4.19±2.39ng/ml,n=63,p0.05)sema4d表達(dá)顯著增加。此外,17β雌二醇能夠顯著抑制jurkat細(xì)胞表面sema4d的表達(dá)(p0.05),也能夠抑制collagen誘導(dǎo)的血小板sema4d切割。心衰病人外周血sema4d表達(dá)水平(8.94±5.89ng/ml)顯著高于正常對照(4.67±2.99ng/ml)(p0.0001)。但不同心衰分級、年齡對sema4d的表達(dá)沒有影響。男性心衰病人(9.26±6.35ng/ml,n=88)較女性心衰病人(8.54±5.26ng/ml,n=69)有增加的趨勢,但無顯著差異(p=0.19)。合并糖尿病(w/dm)的心衰病人(10.45±5.76ng/ml,n=40)較未合并糖尿病的心衰病人(w/odm)(8.42±5.87ng/ml,n=117)sema4d表達(dá)顯著增加。而是否合并高血壓(hp)對sema4d的表達(dá)無顯著影響。2心衰病人外周血t細(xì)胞和血小板表面sema4d表達(dá)水平變化。(1)心衰病人cd3+t細(xì)胞(p=0.002),包括cd4+t細(xì)胞(p=0.006)和cd8+t細(xì)胞(p=0.015)表面sema4d水平顯著升高,提示t細(xì)胞可能是心衰病人血漿中sema4d增加的一個重要來源。(2)心衰病人b細(xì)胞表面sema4d表達(dá)水平?jīng)]有變化(p=0.46),血小板表面sema4d雖然有增加的趨勢,但無顯著差異(p=0.188)。3sema4d敲除促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖和脂肪肝。(1)糖尿病病人血漿中和高脂飲食的小鼠脂肪組織中sema4d表達(dá)增加。elisa檢測結(jié)果表明2型糖尿病病人較正常對照外周血中可溶性sema4d的表達(dá)水平顯著增加,此外喂食高脂飼料的小鼠脂肪組織中sema4d表達(dá)水平顯著增加(p0.05),而sema4d受體plexinb1(p0.05)和plexinb2(p0.05)表達(dá)則顯著下降,cd72表達(dá)無明顯變化。(2)sema4d敲除促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖及胰島素抵抗。sema4d在高脂飲食小鼠脂肪組織中表達(dá)上調(diào)提示sema4d可能參與調(diào)節(jié)肥胖過程,為了證實(shí)這一假說,我們通過高脂飲食喂養(yǎng)的wt和sema4d-/-小鼠8-10周,持續(xù)監(jiān)測其體重變化,結(jié)果顯示雄性和雌性sema4d-/-小鼠分別較wt雄、雌小鼠體重均有顯著增加,sema4d-/-小鼠與wt相比的生殖器脂肪(genitalfat)(p0.01)和腎周脂肪(perirenalfat)(p0.01)占體重的百分比顯著增加。血脂檢測表明sema4d-/-小鼠空腹三脂酰甘油(tg)、tc、ldl-c較wt顯著增加,而hdl-c表達(dá)無明顯變化.此外,sema4d敲除顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠葡萄糖耐受性(p0.05)。(3)sema4d敲除促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝。稱量高脂飲食16周后wt和sema4d-/-小鼠的肝臟和脾臟重量,結(jié)果顯示sema4d-/-小鼠較wt小鼠肝臟(p0.0001)和脾臟(p0.01)重量均有顯著增加。為了驗(yàn)證sema4d對脂肪肝的作用,我們分別取高脂飲食8周和16周的wt和sema4d-/-小鼠的肝臟固定后石蠟包埋,組織切片,he染色分析各組小鼠的脂肪肝嚴(yán)重程度。結(jié)果顯示sema4d-/-組小鼠脂肪肝較wt小鼠更加嚴(yán)重。(4)sema4d敲除對高脂飲食條件下小鼠脂肪組織中炎癥細(xì)胞浸潤的影響。流式細(xì)胞儀檢測高脂飲食條件下wt和sema4d-/-小鼠內(nèi)臟脂肪組織中炎癥細(xì)胞的數(shù)量和比例。結(jié)果顯示sema4d-/-較wt小鼠生殖器脂肪組織中cd45+白細(xì)胞(p=0.0009)、cd4+t細(xì)胞(p=0.02)、cd8+t(p=0.002)細(xì)胞和f4/80+巨噬細(xì)胞(p=0.02)的數(shù)量顯著增加。隨后我們分析不同炎癥細(xì)胞在脂肪組織的百分比,我們發(fā)現(xiàn)cd45+白細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比,以及cd4+t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞占cd45+白細(xì)胞的百分比均沒有顯著變化,cd45+白細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比有增加的趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.15)。cd4+t細(xì)胞(p=0.29)、cd8+t(p=0.09)細(xì)胞百分比也無明顯變化,這可能與sema4d有活化t細(xì)胞的作用有關(guān)。但是,f4/80+巨噬細(xì)胞(p=0.0005)、cd11+m1型巨噬細(xì)胞(p=0.02)占cd45+白細(xì)胞的百分比顯著增加。4sema4d體外抑制脂肪分化從脂肪組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞,傳到第三代后,流式細(xì)胞分析儀檢測間充質(zhì)干細(xì)胞marker(cd90和cd105)的表達(dá)。結(jié)果顯示分離的間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)白細(xì)胞的markercd45,提示干細(xì)胞中沒有白細(xì)胞的污染,并且絕大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的markercd90和cd105;隨后,我們將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種于六孔板,分別轉(zhuǎn)染對照和表達(dá)sema4d細(xì)胞外段的質(zhì)粒,待細(xì)胞長滿后加入脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基,第七天取細(xì)胞進(jìn)行油紅o染色,檢測脂肪分化效率。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了sema4d的細(xì)胞脂肪分化明顯降低。5plexinb1敲除促進(jìn)高脂誘導(dǎo)的脂肪肝。rt-pcr檢測plexinb1在骨骼肌、內(nèi)臟脂肪、肝臟中的表達(dá),已知表達(dá)plexinb1的腎臟作為陽性對照,結(jié)果顯示內(nèi)臟脂肪和肝臟均表達(dá)plexinb1,但肝臟中plexinb1表達(dá)量較高,高脂飲食誘導(dǎo)后小鼠肝臟中plexinb1表達(dá)量明顯下降(p0.01)。剝離高脂飲食喂養(yǎng)wt和plexinb1-/-小鼠的生殖器脂肪和腎周脂肪,并拍照。與sema4d-/-類似,plexinb1敲除也促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。同樣,油紅o染色結(jié)果顯示plexinb1-/-小鼠脂肪肝顯著增加,realtime-pcr結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂代謝相關(guān)基因ppar?1和ppar?2的表達(dá)也顯著上調(diào)。結(jié)論:1.心衰病人特別是合并糖尿病的心衰病人外周血中可溶性sema4d水平較正常人顯著增加,提示sema4d可能成為心衰病人生物標(biāo)志之一。2.心衰病人血漿中可溶性sema4d含量增加與t細(xì)胞包括cd4+t細(xì)胞和cd8+t表面sema4d表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)。3.sema4d敲除促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝。4.sema4對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和脂肪肝的作用可能是通過其受體plexinb1介導(dǎo)的。5.Sema4D體外抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪的分化,可能參與高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54;R589.2

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