本文選題：誘導(dǎo)多能干細胞 + 納米纖維支架　； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：【研究背景】心血管疾病是全球范圍導(dǎo)致人類死亡的首要病因,近些年來每年全球范圍內(nèi)因心血管疾病死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的比例均超過30%,已經(jīng)造成了沉重的社會經(jīng)濟負擔。心肌梗死是最常見的心血管疾病類型,在人群中具有很高的發(fā)病率和死亡率。心肌梗死導(dǎo)致心臟永久性損失數(shù)以億計的功能心肌細胞,這些壞死損失的心肌細胞逐漸被成纖維細胞所形成的瘢痕組織替代,心臟隨之發(fā)生重構(gòu),存活的患者最終將發(fā)展為心力衰竭直至死亡。人類心臟再生能力極為有限,一旦發(fā)生心肌梗死,功能心肌細胞的損失將無法得到彌補。當前所有的治療方法和策略均只為補救性措施,比如藥物治療、冠脈介入手術(shù)治療、以及外科搭橋手術(shù)治療,雖然可以有效延緩疾病的發(fā)展,但它們均無法完全恢復(fù)心臟的功能或是逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)。全心移植是重癥心肌梗死患者目前唯一最有效的根治性治療選擇。在過去的十多年中,干細胞生物學(xué)方面的重大突破使得我們已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)心肌細胞的再生,使得為這類疾病患者提供再生心臟的美好愿望成為可能。然而,當前基于干細胞的移植再生療法仍然存在諸如細胞存活差、細胞滯留低、無法形成功能性心肌組織等難題,尚難以取得滿意療效。因此體外構(gòu)建出可供移植的組織工程心肌移植體就成為了當前新的選擇。【目的】利用誘導(dǎo)多能干細胞與納米纖維支架構(gòu)建較為成熟、具有機械/電偶聯(lián)的一體化組織工程心肌移植物�！痉椒ā�1)分別采用擬胚體法和單層貼壁培養(yǎng)法進行鼠源Oct4-GFP+i PSC(induced pluripotent stem cell)培養(yǎng)分化,并進行心肌細胞標志物免疫染色,明確該i PSC細胞系向心肌細胞分化的可行性。2)添加抗壞血酸素(Ascorbic acid,AA)作為心肌分化誘導(dǎo)劑,觀察、計數(shù)跳動EB的數(shù)量,借以評估抗壞血酸素的心肌分化誘導(dǎo)作用。3)采用靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)聚己內(nèi)酯(Poly-(ε-caprolactone),PCL)和聚己內(nèi)酯/明膠(PCL/Gelatin)復(fù)合納米纖維支架,用于i PSC的心肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng),明確支架平臺可否適用于組織工程心肌構(gòu)建。4)觀察支架對i PSC心肌方向分化的作用,并探討支架微觀形貌對于心肌分化的影響及可能的信號機制。5)采用單層法聯(lián)合多種分化誘導(dǎo)劑進一步提高心肌分化效率,獲取大批量高純度心肌細胞。6)利用納米纖維支架進行i PSC源心肌細胞的成熟化培養(yǎng),并進行成熟化指標評價。7)采用單層法聯(lián)合多種分化誘導(dǎo)劑在納米纖維支架上培養(yǎng)構(gòu)建具有自主節(jié)律、能夠同步收縮/舒張活動的組織工程心肌。【結(jié)果】1)采用懸滴法制得大小均一的擬胚體細胞團,能夠自發(fā)分化出少量跳動的擬胚體;添加抗壞血酸素能夠顯著升高跳動擬胚體的比例,有效促進心肌分化;單層貼壁法同樣也可以誘導(dǎo)我們的i PSC細胞系分化出心肌細胞,免疫染色結(jié)果證實c Tn I陽性細胞存在。證明該i PSC細胞具備心肌分化能力,可用于后續(xù)心肌組織構(gòu)建。2)靜電紡絲技術(shù)成功制得纖維直徑為納米級別的PCL和PCL/Gelatin復(fù)合支架,具備與細胞外基質(zhì)類似的多孔隙三維立體結(jié)構(gòu);支架用于i PSC的培養(yǎng)分化能夠獲得c Tn T陽性、MLC2a陽性的心肌細胞,而且動態(tài)基因表達譜及心肌特異性蛋白質(zhì)表達譜,均證實心肌細胞存在。證實這種納米纖維支架平臺適用于i PSC的心肌分化培養(yǎng)。3)同等分化條件下采用納米纖維支架具有比培養(yǎng)皿更強的促i PSC心肌細胞分化作用,我們認為這一作用與納米纖維支架的微觀形貌有關(guān)。進一步調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路,證實其參與了這一促分化作用。4)三維納米纖維支架聯(lián)合多種促心肌細胞分化因子,能夠促進i PSC在支架上高效向心肌細胞分化。5)支架上分化獲得的心肌細胞在肌節(jié)結(jié)構(gòu)、心肌特異性蛋白MLC2v的表達方面顯著強于培養(yǎng)皿對照,提示納米纖維支架能夠有效促進分化心肌細胞的成熟。6)通過綜合運用分化誘導(dǎo)因子、納米纖維支架和延長培養(yǎng)時間等措施,成功促使心肌細胞肌節(jié)發(fā)育更為完善、電鏡下結(jié)構(gòu)更為清晰、蛋白表達譜也更為成熟。7)利用支架作為培養(yǎng)載體,成功培養(yǎng)出具有自主節(jié)律、同步收縮/舒張的成熟心肌細胞合胞體,并證實這些心肌細胞之間存在大量縫隙連接結(jié)構(gòu),從而構(gòu)成了它們機械/電耦聯(lián)的基礎(chǔ)。綜上所述,靜電紡絲生產(chǎn)的三維立體納米纖維支架非常適合于用作i PSC心肌分化及心肌組織構(gòu)建的平臺;使用這種支架,在誘導(dǎo)因子輔助下能夠培養(yǎng)出更為成熟的心肌細胞,并獲得具有自主節(jié)律、同步化收縮/舒張功能的心肌組織合胞體。我們的研究為今后構(gòu)建可用于移植的組織工程心肌提供了實踐探索經(jīng)驗。
[Abstract]:Myocardial infarction is one of the most common types of cardiovascular disease , and the loss of cardiac muscle cells can not be compensated . In the past decade , all therapies and strategies have been developed into heart failure until death . Objective To investigate the effect of scaffold on myocardial differentiation and to investigate the effect of scaffold morphology on myocardial differentiation . The results showed that it was suitable for the differentiation of myocardial cells . The results showed that the myocardial cells could be used in the differentiation of myocardial cells .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54
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本文編號：1861585