本文選題：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 + 納米纖維支架�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：【研究背景】心血管疾病是全球范圍導(dǎo)致人類(lèi)死亡的首要病因,近些年來(lái)每年全球范圍內(nèi)因心血管疾病死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的比例均超過(guò)30%,已經(jīng)造成了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。心肌梗死是最常見(jiàn)的心血管疾病類(lèi)型,在人群中具有很高的發(fā)病率和死亡率。心肌梗死導(dǎo)致心臟永久性損失數(shù)以?xún)|計(jì)的功能心肌細(xì)胞,這些壞死損失的心肌細(xì)胞逐漸被成纖維細(xì)胞所形成的瘢痕組織替代,心臟隨之發(fā)生重構(gòu),存活的患者最終將發(fā)展為心力衰竭直至死亡。人類(lèi)心臟再生能力極為有限,一旦發(fā)生心肌梗死,功能心肌細(xì)胞的損失將無(wú)法得到彌補(bǔ)。當(dāng)前所有的治療方法和策略均只為補(bǔ)救性措施,比如藥物治療、冠脈介入手術(shù)治療、以及外科搭橋手術(shù)治療,雖然可以有效延緩疾病的發(fā)展,但它們均無(wú)法完全恢復(fù)心臟的功能或是逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)。全心移植是重癥心肌梗死患者目前唯一最有效的根治性治療選擇。在過(guò)去的十多年中,干細(xì)胞生物學(xué)方面的重大突破使得我們已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)心肌細(xì)胞的再生,使得為這類(lèi)疾病患者提供再生心臟的美好愿望成為可能。然而,當(dāng)前基于干細(xì)胞的移植再生療法仍然存在諸如細(xì)胞存活差、細(xì)胞滯留低、無(wú)法形成功能性心肌組織等難題,尚難以取得滿(mǎn)意療效。因此體外構(gòu)建出可供移植的組織工程心肌移植體就成為了當(dāng)前新的選擇�！灸康摹坷谜T導(dǎo)多能干細(xì)胞與納米纖維支架構(gòu)建較為成熟、具有機(jī)械/電偶聯(lián)的一體化組織工程心肌移植物�！痉椒ā�1)分別采用擬胚體法和單層貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行鼠源Oct4-GFP+i PSC(induced pluripotent stem cell)培養(yǎng)分化,并進(jìn)行心肌細(xì)胞標(biāo)志物免疫染色,明確該i PSC細(xì)胞系向心肌細(xì)胞分化的可行性。2)添加抗壞血酸素(Ascorbic acid,AA)作為心肌分化誘導(dǎo)劑,觀察、計(jì)數(shù)跳動(dòng)EB的數(shù)量,借以評(píng)估抗壞血酸素的心肌分化誘導(dǎo)作用。3)采用靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)聚己內(nèi)酯(Poly-(ε-caprolactone),PCL)和聚己內(nèi)酯/明膠(PCL/Gelatin)復(fù)合納米纖維支架,用于i PSC的心肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng),明確支架平臺(tái)可否適用于組織工程心肌構(gòu)建。4)觀察支架對(duì)i PSC心肌方向分化的作用,并探討支架微觀形貌對(duì)于心肌分化的影響及可能的信號(hào)機(jī)制。5)采用單層法聯(lián)合多種分化誘導(dǎo)劑進(jìn)一步提高心肌分化效率,獲取大批量高純度心肌細(xì)胞。6)利用納米纖維支架進(jìn)行i PSC源心肌細(xì)胞的成熟化培養(yǎng),并進(jìn)行成熟化指標(biāo)評(píng)價(jià)。7)采用單層法聯(lián)合多種分化誘導(dǎo)劑在納米纖維支架上培養(yǎng)構(gòu)建具有自主節(jié)律、能夠同步收縮/舒張活動(dòng)的組織工程心肌�！窘Y(jié)果】1)采用懸滴法制得大小均一的擬胚體細(xì)胞團(tuán),能夠自發(fā)分化出少量跳動(dòng)的擬胚體;添加抗壞血酸素能夠顯著升高跳動(dòng)擬胚體的比例,有效促進(jìn)心肌分化;單層貼壁法同樣也可以誘導(dǎo)我們的i PSC細(xì)胞系分化出心肌細(xì)胞,免疫染色結(jié)果證實(shí)c Tn I陽(yáng)性細(xì)胞存在。證明該i PSC細(xì)胞具備心肌分化能力,可用于后續(xù)心肌組織構(gòu)建。2)靜電紡絲技術(shù)成功制得纖維直徑為納米級(jí)別的PCL和PCL/Gelatin復(fù)合支架,具備與細(xì)胞外基質(zhì)類(lèi)似的多孔隙三維立體結(jié)構(gòu);支架用于i PSC的培養(yǎng)分化能夠獲得c Tn T陽(yáng)性、MLC2a陽(yáng)性的心肌細(xì)胞,而且動(dòng)態(tài)基因表達(dá)譜及心肌特異性蛋白質(zhì)表達(dá)譜,均證實(shí)心肌細(xì)胞存在。證實(shí)這種納米纖維支架平臺(tái)適用于i PSC的心肌分化培養(yǎng)。3)同等分化條件下采用納米纖維支架具有比培養(yǎng)皿更強(qiáng)的促i PSC心肌細(xì)胞分化作用,我們認(rèn)為這一作用與納米纖維支架的微觀形貌有關(guān)。進(jìn)一步調(diào)控經(jīng)典Wnt信號(hào)通路,證實(shí)其參與了這一促分化作用。4)三維納米纖維支架聯(lián)合多種促心肌細(xì)胞分化因子,能夠促進(jìn)i PSC在支架上高效向心肌細(xì)胞分化。5)支架上分化獲得的心肌細(xì)胞在肌節(jié)結(jié)構(gòu)、心肌特異性蛋白MLC2v的表達(dá)方面顯著強(qiáng)于培養(yǎng)皿對(duì)照,提示納米纖維支架能夠有效促進(jìn)分化心肌細(xì)胞的成熟。6)通過(guò)綜合運(yùn)用分化誘導(dǎo)因子、納米纖維支架和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間等措施,成功促使心肌細(xì)胞肌節(jié)發(fā)育更為完善、電鏡下結(jié)構(gòu)更為清晰、蛋白表達(dá)譜也更為成熟。7)利用支架作為培養(yǎng)載體,成功培養(yǎng)出具有自主節(jié)律、同步收縮/舒張的成熟心肌細(xì)胞合胞體,并證實(shí)這些心肌細(xì)胞之間存在大量縫隙連接結(jié)構(gòu),從而構(gòu)成了它們機(jī)械/電耦聯(lián)的基礎(chǔ)。綜上所述,靜電紡絲生產(chǎn)的三維立體納米纖維支架非常適合于用作i PSC心肌分化及心肌組織構(gòu)建的平臺(tái);使用這種支架,在誘導(dǎo)因子輔助下能夠培養(yǎng)出更為成熟的心肌細(xì)胞,并獲得具有自主節(jié)律、同步化收縮/舒張功能的心肌組織合胞體。我們的研究為今后構(gòu)建可用于移植的組織工程心肌提供了實(shí)踐探索經(jīng)驗(yàn)。
[Abstract]:Myocardial infarction is one of the most common types of cardiovascular disease , and the loss of cardiac muscle cells can not be compensated . In the past decade , all therapies and strategies have been developed into heart failure until death . Objective To investigate the effect of scaffold on myocardial differentiation and to investigate the effect of scaffold morphology on myocardial differentiation . The results showed that it was suitable for the differentiation of myocardial cells . The results showed that the myocardial cells could be used in the differentiation of myocardial cells .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R54
，

本文編號(hào)：1861585