發(fā)布時(shí)間：2018-05-04 19:19

  本文選題：骨髓增生異常綜合征 + SPAG6基因��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的通過(guò)pGC-SPAG6-shRNA重組慢病毒載體靶向沉默SPAG6基因后,探討SPAG6基因與人骨髓增生異常綜合征(MDS)細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其機(jī)制,為MDS的靶向治療奠定基礎(chǔ)。方法1.明確SPAG6-sh RNA慢病毒載體對(duì)人SPAG6基因干擾效率:將SPAG6-sh RNA及NC-sh RNA慢病毒轉(zhuǎn)染人MDS細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞后,利用熒光顯微鏡觀察其表達(dá)情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率,q RT-PCR及western blot驗(yàn)證SPAG6基因是否被成功干擾。2.探索SPAG6基因的表達(dá)對(duì)TRAIL信號(hào)通路活化的影響:慢病毒轉(zhuǎn)染SKM-1細(xì)胞后,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,western blot檢測(cè)TRAIL通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。3.研究SPAG6基因與TRAIL凋亡通路之間的量的依賴性:同時(shí)利用不同濃度的r TRAIL蛋白處理SKM-1細(xì)胞,相同濃度r TRAIL蛋白分別處理SKM-1、U937及K562三種細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性,western blot檢測(cè)TRAIL通路活化情況。4.探索SPAG6在TRAIL凋亡信號(hào)通路中的作用途徑及關(guān)鍵分子:采用q RT-PCR及western blot檢測(cè)TRAIL通路相關(guān)受體及蛋白的表達(dá)水平,免疫沉淀檢測(cè)二者的結(jié)合情況。結(jié)果1.SPAG6-sh RNA慢病毒成功轉(zhuǎn)染人SKM-1細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察到大量的綠色熒光,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)得其轉(zhuǎn)染率分別為(97.19±3.21)%與(88.31±12.81)%,QRT-PCR及Western blot結(jié)果顯示SKM-1細(xì)胞中SPAG6基因在m RNA及蛋白層面的表達(dá)均被成功抑制。2.SPAG6基因表達(dá)降低后,TRAIL凋亡通路被活化。干擾組的凋亡率明顯高于對(duì)照組(NC-sh RNA 8.65%±2.07%vs.SPAG6-sh RNA20.20%±2.11%,P0.05)。而且,SPAG6干擾組cleaved PARP、caspase-8以及cleaved caspase-8表達(dá)水平均升高,PARP表達(dá)則無(wú)明顯差異。同時(shí),BAK、BAX、BID和caspase-3較對(duì)照組表達(dá)也明顯升高。3.SPAG6基因能抵抗r TRAIL蛋白引起的凋亡。隨著r TRAIL蛋白濃度的增加,SKM-1細(xì)胞凋亡率增加,增殖被抑制,且TRAIL通路活化的相關(guān)蛋白表達(dá)增加。而利用相同濃度的r TRAIL蛋白處理SKM-1、U937及K562時(shí),在U937及K562中,細(xì)胞凋亡及增殖均無(wú)明顯區(qū)別。4.SPAG6能影響FADD與TRAIL通路受體間的相互作用。SPAG6基因表達(dá)被干擾后,FADD的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高,而DR4及DR5的表達(dá)則無(wú)明顯區(qū)別。免疫沉淀的結(jié)果則表明,降低SPAG6表達(dá)后,FADD與DR4和DR5之間的相互作用明顯增加。結(jié)論SPAG6基因能夠通過(guò)影響TRAIL信號(hào)通路的活化調(diào)控SKM-1細(xì)胞的凋亡。其具體機(jī)制可能是細(xì)胞內(nèi)SPAG6基因的高表達(dá)能夠影響FADD的表達(dá),進(jìn)而致使FADD與TRAIL通路凋亡受體結(jié)合減少。
[Abstract]:Objective to investigate the relationship between SPAG6 gene and apoptosis of human myelodysplastic syndromes (MDS) cells by targeting SPAG6 gene silenced by pGC-SPAG6-shRNA recombinant lentivirus vector, and to lay a foundation for the targeted therapy of MDS. Method 1. To determine the interference efficiency of SPAG6-sh RNA lentivirus vector to human SPAG6 gene: after SPAG6-sh RNA and NC-sh RNA lentivirus were transfected into SKM-1 cell line of human MDS cell line, the expression of SPAG6-sh RNA lentivirus vector was observed by fluorescence microscope. The transfection efficiency was detected by flow cytometry. Q RT-PCR and western blot were used to verify whether the SPAG6 gene was successfully interfered with. 2. 2. To explore the effect of SPAG6 gene expression on the activation of TRAIL signaling pathway: after lentivirus transfection into SKM-1 cells, apoptosis was detected by flow cytometry and the expression of TRAIL pathway related protein was detected by western blot. To study the quantitative dependence between SPAG6 gene and TRAIL apoptosis pathway: SKM-1 cells were treated with different concentrations of r TRAIL protein, and SKM-1 U937 and K562 cells were treated with the same concentration of r TRAIL protein, respectively. Cell apoptosis was detected by flow cytometry and the activation of TRAIL pathway was detected by western blot with CCK-8 assay. To explore the role and key molecules of SPAG6 in TRAIL apoptotic signaling pathway, Q RT-PCR and western blot were used to detect the expression of TRAIL receptor and protein, and immunoprecipitation was used to detect their binding. Results 1.SPAG6-sh RNA lentivirus was successfully transfected into human SKM-1 cells. A large amount of green fluorescence was observed under a fluorescence microscope, The results of flow cytometry showed that the transfection rates were 97.19 鹵3.21% and 88.31 鹵12.81%, respectively. The results of QRT-PCR and Western blot showed that the expression of SPAG6 gene at m RNA and protein level in SKM-1 cells was successfully inhibited. 2. The apoptosis pathway of trail was activated after the expression of SPAG6 gene decreased. The apoptosis rate of interference group was significantly higher than that of NC-sh RNA 8.65% 鹵2.07%vs.SPAG6-sh 20.20% 鹵2.11 in control group. Moreover, there was no significant difference in the expression of cleaved PARP caspase-8 and cleaved caspase-8 in SPAG6 interference group. At the same time, the expression of BAXBID and caspase-3 was significantly higher than that of control group. 3. SPAG6 gene could resist the apoptosis induced by r TRAIL protein. With the increase of the concentration of r TRAIL protein, the apoptosis rate of SKM-1 cells increased, the proliferation was inhibited, and the expression of related proteins activated by TRAIL pathway increased. However, when SKM-1U937 and K562 were treated with the same concentration of r TRAIL protein, there was no significant difference in apoptosis and proliferation between U937 and K562. 4. SPAG6 could affect the interaction between SPAG6 and the receptor of TRAIL pathway. The expression of SPAG6 gene in SKM-1U937 and K562 was significantly higher than that in the control group. However, the expression of DR4 and DR5 had no significant difference. The results of immunoprecipitation showed that the interaction between DR4 and DR5 increased significantly after the decrease of SPAG6 expression. Conclusion SPAG6 gene can regulate the apoptosis of SKM-1 cells by affecting the activation of TRAIL signaling pathway. The specific mechanism may be that the high expression of SPAG6 gene in cells can affect the expression of FADD, which leads to the reduction of FADD binding to the apoptotic receptor of TRAIL pathway.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R551.3

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本文編號(hào)：1844318