發(fā)布時間：2018-05-03 23:05

  本文選題：腹主動脈瘤 + ABCA1　； 參考：《昆明醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：第一部分ABCA1基因R219K多態(tài)性與血脂水平和腹主動脈瘤的關(guān)系研究[目的]研究三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1(Adenosine triphosphate binding cassette trarnsporter A1,ABCA1)基因R219K多態(tài)性位點在健康人群和腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)患者中的分布特點,探討R219K各基因型與血脂水平和AAA的關(guān)系。[方法]實驗分為兩組:126例來源于我院血管外科的AAA患者(疾病組)和119例來源于我院健康體檢中心的健康人群(對照組)。采集各樣本外周血分析總膽固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三脂(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)和載脂蛋白 A-I(apolipoprotein A-I,ApoA-I)水平,利用PCR及基因測序技術(shù)檢測各樣本ABCA1基因R219K多態(tài)性,并比較兩組間基因型和等位基因的分布特征,并分析ABCAl基因R219K多態(tài)性與血脂和AAA的關(guān)系。[結(jié)果]①疾病組與對照組相比,TG和LDL-C水平明顯更高(p0.05),HDH-C和ApoA-I水平更低(p0.05);②兩組間ABCA1基因R219K多態(tài)性分布頻率的比較結(jié)果是:RR與KK基因型,R與K等位基因的分布頻率具有統(tǒng)計學差異(p0.05),RK基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);③疾病組中KK和RK基因型攜帶者的HDL-C和ApoA-I水平高于RR基因型攜帶者(p0.05),但TC、TG和LDL-C水平無顯著差別(p0.05);④Logistic回歸分析顯示ABCA1基因R219K多態(tài)性中R等位基因可能與AAA發(fā)病相關(guān)(OR= 3.53,p0.05)。[結(jié)論]ABCA1基因R219K多態(tài)性KK和RK基因型與HDL-C和ApoA-I水平有關(guān)。ABCA1基因R219K多態(tài)性與AAA發(fā)生存在一定相關(guān)性,R等位基因可能是AAA發(fā)病危險因素之一。第二部分ABCA1基因?qū)χ鲃用}平滑肌細胞凋亡的影響及與動脈瘤相關(guān)長鏈非編碼RNA的關(guān)系[.目的]在人主動脈平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中過表達和敲降A(chǔ)BCA1基因后,探討其對主動脈VSMCs凋亡的影響。同時檢測過表達和敲降A(chǔ)BCA1基因后VSMCs中與動脈瘤相關(guān)的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)ANRIL、HIF1A-AS1 和 AK056155 的表達水平,探尋它們之間的相互關(guān)系。[方法]利用RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)在人主動脈VSMCs中釣取ABCA1基因,通過pEGFP-N3構(gòu)建過表達載體轉(zhuǎn)染人主動脈VSMCs。應用qRT-PCR和Western blot技術(shù)驗證ABCA1表達情況。在過表達ABCA1基因的主動脈VSMCs中應用ANNEXIN V-FITC染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況,并應用qRT-PCR 技術(shù)檢測 LncRNAANRIL、HIF1A-AS1 和 AK056155 的表達水平。利用siRNA技術(shù)在人主動脈VSMCs中敲降A(chǔ)BCA1基因。應用qRT-PCR技術(shù)鑒定各siRNA敲降A(chǔ)BCA1的效率,采用敲降效率最高的siRNA做后續(xù)實驗。在敲降A(chǔ)BCA1基因的主動脈VSMC中應用ANNEXIN V-FITC染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況,并應用qRT-PCR技術(shù)檢測LncRNA ANRIL、HIF1A-AS1和AK056155的表達水平。[結(jié)果]成功構(gòu)建ABCA1-pEGFP-N3載體。利用該載體轉(zhuǎn)染人主動脈VSMCs 24h后,轉(zhuǎn)染組各檢測結(jié)果顯示:①ABCAlmRNA-水平和蛋白表達水平顯著高于對照組(均為p0.05);②主動脈VSMCs凋亡率較對照組下降(p0.05);③主動脈VSMCs中LncRNAANRIL、HIF1A-AS1和AK056155水平均較對照組減少(均為p0.05),其中LncRNAANRIL變化最顯著。合成3個siRNA-ABCA1轉(zhuǎn)染人主動脈VSMCs后,qRT-PCR驗證siRNA-ABCA1-1的干擾效率最佳,采用其進行后續(xù)實驗。siRNA-ABCA1-1轉(zhuǎn)染組各檢測結(jié)果顯示:①ABCA1 mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組(均為p0.05);②主動脈VSMCs凋亡率較對照組增加(p0.05);③主動脈VSMCs中LncRNA ANRIL、HIF1A-AS1和AK056155的表達水平均較對照組增加(均為p0.05),其中LncRNAANRIL變化最顯著。[結(jié)論]①成功構(gòu)建過表達和敲降A(chǔ)BCA1基因的主動脈VSMCs細胞模型;②在體外細胞實驗中過表達ABCA1,可以使主動脈VSMCs的凋亡減少,而敲降A(chǔ)BCA1基因可使主動脈VSMCs的凋亡增加;③同時,體外細胞實驗中過表達和敲降A(chǔ)BCA1基因分別可以上調(diào)和下調(diào)與動脈瘤相關(guān)的LncRNA ANRIL、HIF1A-AS1和AK056155的表達水平,其中變化趨勢最明顯的是LncRNA ANRIL。④這可能表明ABCA1基因參與了人主動脈VSMCs的病理生理過程并與LncRNAANRIL可能存在調(diào)控關(guān)系。第三部分ABCA1基因相關(guān)的長鏈非編碼RNA對主動脈平滑肌細胞凋亡和增殖的影響[目的]在人主動脈VSMCs中過表達和敲降LncRNAANRIL,研究其對主動脈VSMCs凋亡和增殖的影響。[方法]利用RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)在人主動脈VSMCs中釣取ANRIL基因,通過pEGFP-N3構(gòu)建過表達載體轉(zhuǎn)染人主動脈VSMCs。應用qRT-PCR驗證LncRNA ANRIL表達水平。在過表達LncRNA ANRIL的主動脈VSMCs中應用ANNEXIN V-FITC染色結(jié)合流式細胞術(shù)、MTT比色法和Western blot技術(shù)檢驗細胞的凋亡、增殖情況及凋亡相關(guān)蛋白Caspase3和Bcl-2的表達水平。利用siRNA技術(shù)在人主動脈VSMCs中敲降LncRNAANRIL。應用qRT-PCR技術(shù)鑒定siRNA敲降A(chǔ)NRIL的效率,采用敲降效率最高的siRNA做后續(xù)實驗。在敲降A(chǔ)NRIL基因的主動脈VSMCs中應用ANNEXIN V-FITC染色結(jié)合流式細胞術(shù)、MTT比色法和Western blot技術(shù)檢驗細胞的凋亡、增殖情況及凋亡相關(guān)蛋白Caspase3和Bcl-2的表達水平。[結(jié)果]成功構(gòu)建ANRIL-pEGFP-N3載體。利用該載體轉(zhuǎn)染人主動脈VSMCs 24h后,轉(zhuǎn)染組各檢測結(jié)果顯示:①LncRNAANRIL水平顯著高于對照組(p0.05);②主動脈VSMCs凋亡率高于對照組(p0.05);③細胞溶液在A=490nm處的OD值低于對照組(p0.05)。④Caspase3水平較對照組升高,Bcl-2水平較對照組降低(均為p0.05)。合成3個ANRIL-siRNA轉(zhuǎn)染人主動脈VSMCs后,qRT-PCR驗證siRNA-ANRIL-3的干擾效率最佳,采用其進行后續(xù)實驗。siRNA-ANRIL-3轉(zhuǎn)染組各檢測結(jié)果顯示:①LncRNAANRIL水平顯著低于對照組(p0.05);②主動脈VSMC凋亡率低于對照組(p0.05);③細胞溶液在A=490nm處的OD值高于對照組(p0.05)。④Caspase3水平較對照組下降,Bcl-2水平較對照組升高(均為p0.05)。[結(jié)論]①成功構(gòu)建過表達和敲降LncRNAANRIL的主動脈VSMCs細胞模型;②在體外細胞實驗中過表達LncRNAANRIL,可以使主動脈VSMCs的凋亡增加、抑制增殖,而敲降LncRNAANRIL可使主動脈VSMCs的凋亡減少、促進增殖;③鑒于ABCA1和LncRNA ANRIL在主動脈VSMC凋亡與增殖中的作用,我們推測ABCA1與LncRNA ANRIL的相互作用在主動脈VSMC病理生理過程發(fā)揮重要作用,進而影響AAA發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:The distribution of ABCA1 gene R219K in healthy population and abdominal aortic aneurysm ( AAA ) was studied by PCR and gene sequencing . The expression level of ABCA1 gene R219K was significantly higher than that of control group ( p < 0.05 ) . The apoptosis , proliferation and the expression level of apoptosis - related protein Caspase3 and Bcl - 2 in aortic smooth muscle cells were investigated by means of RNA extraction , RT - PCR and Western blot . Conclusion : 鈶，

本文編號：1840471