本文選題：腺苷A2受體 + Src酪氨酸激酶　； 參考：《天津醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：目的1.觀察腺苷A2受體活化對心肌再灌注時線粒體氧化應(yīng)激損傷的保護作用。2.探討腺苷A2受體活化誘導心肌再灌注損傷保護作用的線粒體機制。方法建立離體大鼠心臟缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷模型和心肌H9c2細胞系模擬I/R損傷模型。采用透射電鏡和高分辨率呼吸測定儀評定分離線粒體的結(jié)構(gòu)和功能改變。利用線粒體熒光探針JC-1、總活性氧(Reactive oxygen species,ROS)熒光探針DCFH-DA、線粒體超氧化物熒光探針Mitosox Red分別測定分離心肌線粒體和細胞的線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm)、總ROS和線粒體超氧化物水平。使用Amplex red過氧化氫/過氧化物酶檢測試劑盒(Amplex red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit)測定H2O2含量及過氧化氫酶(Catalase)活性。用線粒體腫脹實驗評定線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial permeablity transition pore,mPTP)的開放程度。用蛋白羰基化檢測確定線粒體蛋白的氧化應(yīng)激損傷程度。Western blotting法檢測蛋白表達水平。利用復(fù)合體I酶活性檢測試劑盒(Complex I enzyme activity dipstick assay kit)檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合體I的活性。免疫沉淀法富集線粒體復(fù)合體I并檢測其蛋白酪氨酸磷酸化水平,并用質(zhì)譜確定酪氨酸磷酸化水平發(fā)生變化的目標復(fù)合體亞單位,用NetPhosK 1.0確定目標復(fù)合體亞單位的潛在酪氨酸磷酸化位點。結(jié)果1.與sham組相比,I/R組的呼吸控制率(Respiratory control ratio,RCR)下降,腫脹破裂的線粒體增多,△Ψm降低,線粒體對鈣離子的抵抗能力減弱,但用非選擇性腺苷受體激動劑5’-N-乙基酰胺基腺苷(5’-(N-ethylcarboxamido)adenosine,NECA)處理后這些變化均減輕(均P0.05)。選擇性腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261(SCH)和A2B受體拮抗劑MRS1706(MRS)能夠不同程度地減弱NECA對線粒體的保護作用(均P0.05)。這些結(jié)果表明,腺苷A2A和A2B受體均參與NECA對I/R誘發(fā)的心肌線粒體損傷的保護作用。2.I/R后線粒體蛋白羰基化,線粒體總ROS、H2O2增多,提示再灌注后線粒體ROS增多引起氧化應(yīng)激損傷(均P0.05)。給予NECA能夠明顯抑制線粒體ROS的增多,減輕線粒體的氧化應(yīng)激損傷,但此作用被SCH或MRS抑制。以上結(jié)果表明,腺苷A2A或A2B受體活化能夠抑制再灌注早期ROS的增多而減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷。3.細胞實驗證實,NECA能夠抑制I/R引起的△Ψm減低和ROS增多;線粒體超氧化物歧化酶Peg-SOD具有與NECA類似的作用;二者聯(lián)合應(yīng)用對△Ψm的保護作用增強(均P0.05)。與sham組相比,I/R組超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性降低,但NECA對其活性沒有影響;而NECA能夠明顯增強過氧化氫酶的活性但此作用被SCH或MRS抑制(均P0.05)。這些結(jié)果表明腺苷A2A或A2B受體活化通過增加過氧化氫酶的活性而促進H2O2的分解并減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷。4.與sham組相比,I/R時線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性增強,但被NECA、CGS或BAY所抑制(均P0.05),表明腺苷A2A或A2B受體活化可能通過抑制再灌注期復(fù)合體I的活性而減少ROS的產(chǎn)生。5.與對照組相比,NECA能夠增加線粒體Src酪氨酸激酶活性,但此作用被MRS抑制;選擇性Src酪氨酸激酶拮抗劑PP2能夠減弱NECA對I/R引起的心肌線粒體△Ψm的降低、線粒體對鈣離子的抵抗能力減弱以及ROS產(chǎn)生增多等作用(均P0.05)。另外與NECA組相比,PP2+NECA組復(fù)合體I的活性降低。以上結(jié)果表明,腺苷A2受體活化通過激活線粒體Src酪氨酸激酶而抑制復(fù)合體I的活性并抑制再灌注期ROS增多,從而減輕I/R誘導的心肌線粒體損傷。6.質(zhì)譜和NetPhosK 1.0分析推斷出復(fù)合體I NDUFV2亞單位的Tyr-118,191和192位點,NDUFS3的Tyr-146,245位點以及NDUFS2的Tyr-151位點可能起負性調(diào)節(jié)復(fù)合體I活性的作用。結(jié)論1、腺苷A2A或A2B受體激活后,一方面通過抑制復(fù)合體Ⅰ的活性減少再灌注時ROS的產(chǎn)生,另一方面通過增加過氧化氫酶的活性而促進ROS的分解,抑制mPTP的開放,進而減輕再灌注時線粒體的氧化應(yīng)激損傷。2、NECA通過腺苷A2受體激活線粒體Src酪氨酸激酶,從而抑制復(fù)合體I活性并抑制ROS的產(chǎn)生,減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷。3、復(fù)合體I NDUFV2亞單位的Tyr-118,191和192位點,NDUFS3的Tyr-146,245位點以及NDUFS2的Tyr-151位點可能具有負性調(diào)節(jié)復(fù)合體Ⅰ活性的作用。
[Abstract]:Objective 1. to observe the protective effect of adenosine A2 receptor activation on oxidative stress damage of mitochondria during myocardial reperfusion.2. to explore the mitochondrial mechanism of the protective effect of adenosine A2 receptor activation induced myocardial reperfusion injury. Methods the isolated rat model of myocardial ischemia / reperfusion (Ischemia/reperfusion, I/R) injury and myocardial H9c2 cell line simulation I/R were established. The structure and function of isolated mitochondria were assessed by transmission electron microscopy and high-resolution breathing apparatus. The mitochondrial fluorescence probe JC-1, Reactive oxygen species (ROS) fluorescent probe DCFH-DA, and mitochondrial superoxide fluorescent probe Mitosox Red were used to separate mitochondria and mitochondria from mitochondria and mitochondria respectively. Membrane potential (Mitochondrial membrane potential, delta m), total ROS and mitochondrial superoxide levels. Determine the content and catalase activity using the Amplex red peroxide / peroxidase assay kit (Amplex red hydrogen peroxide/peroxidase assay). The mitochondrial permeability test was used to evaluate the mitochondrial permeability. The opening degree of Mitochondrial permeablity transition pore (mPTP) was detected by protein carbonylation to determine the oxidative stress damage degree of mitochondrial protein,.Western blotting method was used to detect protein expression level. The detection of mitochondrial respiration by the complex I enzyme activity detection kit (Complex I enzyme activity) The activity of the chain complex I. The immunoprecipitation method enriched the mitochondrial complex I and detected its protein tyrosine phosphorylation level, and determined the target complex subunit of the tyrosine phosphorylation level by mass spectrometry. The potential tyrosine phosphorylation site of the target complex subunit was determined by NetPhosK 1. Results 1. compared with the sham group, the I/R group was compared with the group I/R. The respiratory control rate (Respiratory control ratio, RCR) decreased, the swelling and ruptured mitochondria increased, delta m decreased, and the mitochondrial resistance to calcium decreased, but these changes were reduced after treatment with non selective adenosine receptor agonist 5 '-N- ethyl amidosyladenosine (5' - (N-ethylcarboxamido) adenosine, NECA). Sexual adenosine A2A receptor antagonist SCH58261 (SCH) and A2B receptor antagonist MRS1706 (MRS) can weaken the protective effect of NECA on mitochondria in varying degrees (P0.05). These results suggest that adenosine A2A and A2B receptors are involved in the protective action of NECA on mitochondrial damage induced by I/R, mitochondria protein carbonylation. 2 increased, suggesting that the increase of mitochondrial ROS caused oxidative stress injury (all P0.05). NECA could inhibit the increase of mitochondrial ROS and reduce oxidative stress damage of mitochondria, but this effect was inhibited by SCH or MRS. The above results showed that the activation of adenosine A2A or A2B receptor can inhibit the increase of early ROS in reperfusion and reduce the grain size. .3. cell experiments of oxidative stress damage confirmed that NECA could inhibit the decrease of delta m and ROS increase caused by I/R; mitochondrial superoxide dismutase Peg-SOD had a similar role to NECA; the two combined application of the protection of delta m was enhanced (P0.05). The activity of I/R group superoxide dismutase (Superoxide) was compared with the sham group. Sex decreased, but NECA had no effect on its activity, while NECA could significantly enhance the activity of catalase, but this effect was inhibited by SCH or MRS (P0.05). These results suggest that the activation of adenosine A2A or A2B receptor activates the decomposition of H2O2 by increasing the activity of catalase and reduces the oxidative stress of linear particles compared to sham groups, I/R. The mitochondrial respiratory chain complex I activity was enhanced, but was inhibited by NECA, CGS or BAY (P0.05), indicating that the activation of adenosine A2A or A2B receptor may reduce ROS production by inhibiting the activity of the reperfusion phase complex I, and that NECA can increase the activity of mitochondrial Src tyrosine kinase, but this effect is inhibited; selective tyrosine The acid kinase antagonist PP2 can weaken the decrease of NECA induced I/R induced mitochondrial delta m, the decrease of mitochondrial resistance to calcium and the increase of ROS production (P0.05). In addition, the activity of I in the PP2+NECA complex is reduced compared with the NECA group. The results show that the activation of adenosine A2 receptor activates the mitochondrial Src tyrosine. The kinase inhibits the activity of the complex I and inhibits the increase of ROS in the reperfusion period, thus reducing the I/R induced myocardial mitochondrial damage by.6. mass spectrometry and NetPhosK 1 analysis to deduce the Tyr-118191 and 192 loci of the complex I NDUFV2 subunit, and the NDUFS3 Tyr-146245 loci and NDUFS2 Tyr-151 positions may play a negative role in regulating the activity of the complex. Conclusion 1, after the activation of adenosine A2A or A2B receptor, one side reduces the production of ROS by inhibiting the activity of complex I, on the other hand, by increasing the activity of the catalase, it promotes the decomposition of ROS, inhibits the opening of mPTP, and then reduces the mitochondrial oxygenation stress damage.2, NECA activates the grain by adenosine A2 receptor. Src tyrosine kinase, which inhibits the activity of complex I and inhibits the production of ROS, reduces the mitochondrial oxidative stress damage.3, the Tyr-118191 and 192 loci of the I NDUFV2 subunit of the complex, and the Tyr-146245 site of NDUFS3 and the Tyr-151 site of NDUFS2 may have a negative regulation of the activity of complex I activity.

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：1820602