本文選題：自發(fā)性高血壓大鼠 + -磷酸鞘氨醇受體��； 參考：《中華男科學(xué)雜志》2017年02期

【摘要】：目的:篩選出能夠高效特異性沉默自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞(CCSMC)內(nèi)1-磷酸鞘氨醇受體3(S1PR3)基因表達(dá)的siRNA慢病毒載體,并觀察其對(duì)SHR CCSMC ROCK1、ROCK2、e NOS表達(dá)的影響。方法:以大鼠S1PR3基因mRNA序列作為干擾靶點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成3對(duì)靶向S1PR3的siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及1對(duì)陰性對(duì)照序列,構(gòu)建并包裝成慢病毒載體。體外培養(yǎng)SHR CCSMC及魏-凱二氏大鼠(WKY)CCSMC,隨機(jī)分為A組(SHR對(duì)照組)、B組(攜帶陰性對(duì)照病毒的SHR CCSMC轉(zhuǎn)染組)、C~E組(分別攜帶靶向S1PR3基因siRNA 1~3號(hào)靶點(diǎn)慢病毒的SHR CCSMC轉(zhuǎn)染組),F組(WKY對(duì)照組),以感染復(fù)數(shù)(MOI)=60轉(zhuǎn)染SHR CCSMC,轉(zhuǎn)染后觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況,并用RT-PCR和Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中S1PR3、ROCK1、ROCK2、e NOS mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:經(jīng)基因測(cè)序證明慢病毒載體構(gòu)建成功。熒光顯微鏡下觀察B~E組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均80%。與A組相比,B組S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表達(dá)均無明顯改變(P均0.05),C、D、E、F組的S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表達(dá)均較A組顯著下降(P均0.05),其中E組抑制作用最為明顯,使S1PR3 mRNA及蛋白表達(dá)的抑制效率分別為(34.2±2.9)%、(77.7±4.7)%;ROCK1 mRNA及蛋白表達(dá)的抑制效率分別為(33.3±1.4)%、(51.1±7.3)%;ROCK2 mRNA及蛋白表達(dá)的抑制效率分別為(30.8±3.6)%、(58.32±5.5)%。A組e NOS mRNA及蛋白表達(dá)分別與B、C、D、E比較無明顯差異(P均0.05),但較F組顯著降低(P0.05);與F組比較,E組S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表達(dá)均無明顯改變(P均0.05),A、B、C、D組的S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于F組(P均0.05),A、B、C、D、E組e NOS mRNA及蛋白表達(dá)均較F組顯著降低(P均0.05)。結(jié)論:本研究構(gòu)建的3條攜帶不同位點(diǎn)的S1PR3基因的siRNA慢病毒載體均能夠顯著抑制SHR CCSMC內(nèi)S1PR3基因的表達(dá),并能有效抑制SHR CCSMC中上調(diào)的Rho A/Rho激酶信號(hào)通路,其中攜帶siRNA3慢病毒載體的抑制效率最高。
[Abstract]:Aim: to screen out the siRNA lentivirus vector which can specifically silence the gene expression of 1-sphingosine receptor 3nS1PR3 in the smooth muscle cells of the cavernous body of spontaneously hypertensive rats (SHR), and to observe the effect of the vector on the expression of SHR CCSMC rok1 roCK2e NOS.Methods: using the mRNA sequence of rat S1PR3 gene as the interference target, we designed and synthesized 3 pairs of siRNA sequences targeting S1PR3 and 1 pair of negative control sequences, and constructed and packaged the lentivirus vector.SHR CCSMC and WKYY CCSMCs were cultured in vitro. They were randomly divided into two groups: group A (SHR CCSMC transfection with negative control virus) group (SHR CCSMC transfection group with siRNA 1 ~ 3 target for S1PR3 gene 1 ~ 3) and control group B (SHR CCSMC transfection group with siRNA 1 ~ 3 target for S1PR3 gene 1 ~ 3) was randomly divided into two groups: group A and group B (SHR CCSMC transfection group with negative control virus) (SHR CCSMC transfection group with siRNA 1 ~ 3 target for S1PR3 gene).SHR CCSMCs were transfected with MMOION60 and the expression of green fluorescent protein (GFP) was observed after transfection.RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of S1PR3, ROCK1, ROCK2e NOS mRNA and protein in transfected cells.Results: the construction of lentivirus vector was proved by gene sequencing.The transfection efficiency of BNE group was 80% under fluorescence microscope.Compared with group A, the expression of mRNA and protein in S1PR3, ROCK1, ROCK2 and protein in group S1PR3, ROCK1, ROCK2 and protein were significantly decreased in group S1PR3, ROCK1, ROCK2 and protein, especially in group E (P < 0. 05), and the inhibitory effect in group E was the most obvious, and the expression of mRNA and protein in group S1PR3, ROCK1, ROCK2 and protein were significantly decreased compared with group A (P < 0. 05).The inhibitory rates of S1PR3 mRNA and protein expression were 34.2 鹵2.9 and 77.7 鹵4.7, respectively. The inhibitory rates of S1PR3 mRNA and protein expression were 33.3 鹵1.4 and 51.1 鹵7.3, respectively. The inhibition rates of S1PR3 mRNA and protein expression were 30.8 鹵3.60.32 鹵5.55.50.There was no significant difference between group A and group A in NOS mRNA and protein expression (P 0.05).However, compared with F group, the expression of S1PR3, ROCK1, ROCK2 mRNA and protein in E group were not significantly changed compared with that in F group, and the expression of S1PR3, ROCK1, ROCK2 mRNA and protein in group S1PR3, ROCK1, ROCK2 and protein were significantly higher than those in group F, and the expression of e NOS mRNA and protein in group E were significantly lower than those in group F (P < 0.05).Conclusion: the three siRNA lentivirus vectors with different S1PR3 loci can significantly inhibit the expression of S1PR3 gene in SHR CCSMC and the up-regulated Rho A/Rho kinase signaling pathway in SHR CCSMC.Among them, the inhibition efficiency of siRNA3 lentivirus vector was the highest.
【作者單位】： 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科;
【基金】：四川省科技廳基金(14JC0803) 四川省教育廳基金(15ZA0164) 四川省人力資源和社會(huì)保障廳回國人員科研基金(川人社辦發(fā)[2016]64號(hào))~~
【分類號(hào)】：R544.1;R698

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9 張U，

本文編號(hào)：1766523