本文選題：骨髓增生異常綜合征 + 阿扎胞苷��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：骨髓增生異常綜合癥(myelodysplastic syndrome. MDS)是一組起源于造血干細(xì)胞的異質(zhì)性、惡性克隆性疾病,基本病變是克隆性造血干、祖細(xì)胞發(fā)育異常(dysplasia),導(dǎo)致無效造血或病態(tài)造血,高風(fēng)險向急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)轉(zhuǎn)化,臨床表現(xiàn)為難治性一系或多系細(xì)胞減少的血液病,疾病的結(jié)局主要是死于血細(xì)胞減少導(dǎo)致的感染和出血等合并癥以及向AML演變。任何年齡均可發(fā)病,但常見于老年人,約80%的患者年齡均大于60歲。國外流行病學(xué)顯示年發(fā)病率約3/10萬～3.5/10萬,隨年齡增長有上升趨勢,中位年齡60-75歲,男女比例為1.2：1,男性略多于女性,女性每年的發(fā)病率為2.7/10萬,而男性為4.5/10萬。目前MDS的診斷仍沒有所謂的“金標(biāo)準(zhǔn)”,主要是采用多因素、綜合性和動態(tài)的指標(biāo),根據(jù)患者的病史、體檢、血常規(guī)、血清鐵蛋白水平、維生素B12水平、EPO水平、FA水平、骨髓涂片、活檢、染色體、流式、FISH,基因突變以及排他性疾病檢測,參照維也納標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行評估分析從而診斷。治療骨髓增生異常綜合癥主要解決兩大問題：AML轉(zhuǎn)化、骨髓衰竭及并發(fā)癥。骨髓增生異常綜合癥是一種異質(zhì)性疾病,自然病程和預(yù)后差異很大,應(yīng)根據(jù)患者的國際預(yù)后評分(IPSS-R),同時結(jié)合患者體能狀況(ECOG)、年齡、依從性等各方面進(jìn)行綜合評定,從而選擇治療方案。一般而言,較低危MDS以低強(qiáng)度治療為主,以改善造血,提高生活質(zhì)量乃至延長生存期；中高危組MDS以高強(qiáng)度治療為主,包括化療和異基因造血干細(xì)胞移植(Allo-HSCT),以獲得緩解、提高存活、改變自然病程和改善生活質(zhì)量為主要目標(biāo)。關(guān)于中高危骨髓增生異常綜合癥的治療療效仍是世界型難題,異基因造血干細(xì)胞移植依然是唯一能根治MDS的方法,但MDS多為老年患者,大部分已喪失移植機(jī)會,而對于稍年輕患者,供體干細(xì)胞來源的限制、費用、移植相關(guān)并發(fā)癥等因素也大大限制了其廣泛應(yīng)用。去甲基化藥物(Hypomethylating agents, HMAs)出現(xiàn)之前,除了支持治療和造血生長因子,并沒有特殊藥物能改變其難治性疾病的面貌,而中高危MDS患者的治療方案普遍都是化療,但反應(yīng)率很低,且不良事件多,亦無法遏制其向白血病轉(zhuǎn)化。去甲基化藥物,包括地西他濱(Decitibine,DAC)和阿扎胞苷(Azacitidine, AZA),治療MDS的總反應(yīng)率(overall response,OR)為40-60%,且可能改變MDS的自然病程。自2006年去甲基化藥物地西他濱首次被FDA批準(zhǔn)使用后,現(xiàn)已成為國內(nèi)外中高危骨髓增生異常綜合征的一線治療方法,大量多中心Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗數(shù)據(jù)表明,地西他濱較傳統(tǒng)的化療、對癥支持治療,顯示出很大的優(yōu)勢性。然而,地西他濱雖對MDS療效顯著,但臨床使用中仍存在很多問題。第一費用高,在中國地西他濱屬于自費用藥,按標(biāo)準(zhǔn)劑量20mg/m2/d,共計5天用量,一個療程約5萬；第二、起效慢,國內(nèi)外研究表明地西他濱需使用4-6療程后方能評價其是否有效,這同時也意味著對于中國患者,你需花費20-30萬的費用方可知其是否有效；第三、無停藥指征,臨床使用過程中發(fā)現(xiàn)中途停藥患者,會疾病復(fù)發(fā)或療效喪失,且體外研究發(fā)現(xiàn)在中斷用藥后,MHL1基因啟動子的再次甲基化；第四、耐藥發(fā)生率高,臨床結(jié)果顯示,地西他濱的總反應(yīng)率為50%,即約一半的患者對此藥無效(稱之為原發(fā)性耐藥),而另一部分患者在用藥有效過程中,疾病復(fù)發(fā)或喪失原有療效(稱之為繼發(fā)性耐藥)。且一旦發(fā)生去甲基化藥物耐藥,患者預(yù)后都很差。目前,該藥物的具體耐藥機(jī)制不明,但有研究指出藥物的代謝途徑在疾病的耐藥機(jī)制中起著重要的作用。在體內(nèi),地西他濱如同其他胞嘧啶核苷類似物一樣,通過平衡型核苷轉(zhuǎn)運蛋白hENT1與hENT2進(jìn)入細(xì)胞,一部分并在細(xì)胞內(nèi)由脫氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase, DCK)進(jìn)行磷酸化,將其轉(zhuǎn)化成單磷酸化衍生物5-AZA-dCMP。隨后,5-AZA-dCMP進(jìn)一步磷酸化成其活性模式5-AZA-dCTP納入DNA,從而誘導(dǎo)脫甲基化作用。此外,另一部分進(jìn)入胞內(nèi)的地西他濱經(jīng)過胞苷脫氨酶(Cytidine deaminase, CDA)轉(zhuǎn)化為代謝物質(zhì)5-AZA-UdR排出體外。早在1993年,Stegmann AP等便發(fā)現(xiàn)在地西他濱的耐藥細(xì)胞株模型中,DCK的活性表達(dá)在其耐藥機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。隨后,他們在小鼠的白血病細(xì)胞株中,180天內(nèi)逐步將地西他濱濃度從0.1mmol/L增加至10mmol/L,從而建立耐藥細(xì)胞株,并在此過程中監(jiān)測DCK的活性表達(dá),結(jié)果提示在所有成功建立了的繼發(fā)性地西他濱耐藥的細(xì)胞株中,DCK基因出現(xiàn)基因缺失及多種基因突變,而當(dāng)對該耐藥細(xì)胞株轉(zhuǎn)入DCK基因時,又恢復(fù)對地西他濱的敏感性。再者,他們又在急性髓系白血病的小鼠動物模型中進(jìn)一步驗證出DCK的基因突變亦可以誘導(dǎo)出地西他濱的耐藥。近年來,Qin.T等在體外實驗研究發(fā)現(xiàn),5種原發(fā)性耐藥細(xì)胞株Jurkat, MOLT4, PC3, RKO與DU145中,均出現(xiàn)DCK、hENT1與hENT2的低表達(dá)以及CDA的高表達(dá)。其中,在Jurkat細(xì)胞株與DU145細(xì)胞株中,由mRNA水平?jīng)Q定的DCK蛋白表達(dá)水平很低,而地西他濱的半數(shù)抑制濃度(IC50)恰恰與DCK的mRNA表達(dá)水平相關(guān)(R=0.63,P=0.038),這表明DCK基因的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平與地西他濱的耐藥相關(guān)。此外,在白血病細(xì)胞株HL60中,地西他濱過度暴露亦會誘導(dǎo)其自身耐藥,且與DCK基因由雜合子突變成純合子相關(guān)。目前,研究發(fā)現(xiàn)在對阿糖胞苷產(chǎn)生耐藥的套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中,最重要的分子學(xué)特征是DCK基因的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平,同時亦會對另一種核苷酸類似物吉西他濱產(chǎn)生交叉耐藥。在乳腺癌的細(xì)胞株中亦證實該核苷酸類似物吉西他濱的耐藥機(jī)制與DCK基因表達(dá)下調(diào)相關(guān),使用siRNA方法對該DCK基因進(jìn)行基因敲除后會產(chǎn)生吉西他濱耐藥,而相反,對該基因進(jìn)行表達(dá)上調(diào)時,恢復(fù)吉西他濱藥物敏感性�？傊�,MDS是一組高度異質(zhì)性的惡性疾病,去甲基化治療雖是其治療史上的里程碑,但尚存在很多不足,我們試圖通過從甲基化藥物的臨床資料、相關(guān)代謝基因水平及凋亡基因水平、基因突變等方面,尋找可能為MDS患者提供可預(yù)測去甲基化療效以及患者生存期的指標(biāo)、探索其耐藥的相關(guān)機(jī)制。本論文分三部分：第一部分：去甲基化藥物治療MDS患者的臨床療效預(yù)測指標(biāo)目的：回顧性分析我院接受去甲基化藥物治療的骨髓增生異常綜合征患者,探討其療效及生存期與臨床特征的關(guān)系。方法：回顧性分析我院自2009年11月至2013年11月接收去甲基化藥物治療2個療程以上的60例初診骨髓增生異常綜合征患者(共計接受537個療程,中位療程數(shù)為7療程,2-23療程)。收集患者所有的臨床資料,包括患者用藥方案、年齡、性別、初診時診斷分型、IPSS評分、細(xì)胞遺傳學(xué)及患者用藥前血小板數(shù)值、治療第一療程后血小板數(shù)值、治療第二療程后血小板數(shù)值,同時為進(jìn)一步探索患者血小板增倍與總生存時間的關(guān)系,我們對所有患者進(jìn)行2年以上的生存期隨訪,每1-3月電話隨訪一次,直至患者死亡或失訪。采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,接受去甲基化治療進(jìn)行療效判定的有效組與無效組間的患者分布特征使用卡方檢驗(Pearson Chi-square test)或費舍爾精確檢驗(Fisher's exact test),而兩組間的生存時間采用Kaplan-Meier法進(jìn)行檢驗。結(jié)果：1、60例初診MDS患者接受去甲基化藥物治療,共計接受573個療程,中位療程數(shù)為7個療程(2-23療程)。該60例患者中,平均中位年齡為59歲(33-79歲),其中18例患者接受阿扎胞苷,42例患者接受地西他濱�；赪HO診斷標(biāo)準(zhǔn)的RAEB-Ⅰ患者16例,RAEB-Ⅱ患者33例,骨髓原始細(xì)胞30%的急性髓系白血病患者1例。根據(jù)IPSS (International Prognosis Scoring System)評分標(biāo)準(zhǔn),38例患者細(xì)胞遺傳學(xué)好,12例患者細(xì)胞遺傳學(xué)差,余10例患者中等。根據(jù)MDS國際工作組療效評判標(biāo)準(zhǔn),33例患者治療有效,27例患者治療無效,總反應(yīng)率為55%。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),阿扎胞苷與地西他濱間的療效相當(dāng)(P=0.234)。年齡(P=0.069),性別(P=0.759),IPSS評分(P=0.115)及細(xì)胞遺傳學(xué)(P=0.839)均與去甲基化藥物的療效無關(guān),但初診時診斷為較低危MDS患者(RCMD)的療效則顯著低于較高�；颊�(P=0.033)。2、在這60例患者中,18例患者接受去甲基化治療2個療程后達(dá)到血小板增倍,其中15患者治療有效,即在接受去甲基化藥物2個療程后達(dá)到血小板增倍的患者總反應(yīng)率為83.33%。且在該18例患者中,用藥前血小板中位數(shù)值為39x 109/L[標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation, SD) 55×109/L,范圍：10-174×109/L],接受治療1個療程后增長到74×109/L(SD:118×109/L, range:18-391 ×109/L),2個療程后增長至164×109/L(標(biāo)準(zhǔn)差：168×109/L,范圍：25-730×109/L)(圖1)。而其他42例未達(dá)到血小板增倍的患者中,2個療程后18例患者治療有效,總反應(yīng)率為42.86%。進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),接受去甲基化藥物治療2療程后,發(fā)生血小板增倍的患者有效率明顯高于未發(fā)生者(83.33% VS 42.86%,P=0.004),即2個療程后血小板達(dá)到增倍是去甲基化治療有效的一項臨床預(yù)測指標(biāo)。3、在接受地西他濱治療的患者中,血小板增倍的患者生存期更長(中位生存期,38月VS 14月,P=0.021), 而單獨接受阿扎胞苷的患者中,血小板增倍的患者生存期并未發(fā)生變化。但綜合年齡、性別、IPSS評分、是否移植進(jìn)行多因素生存分析發(fā)現(xiàn),無論是地西他濱抑或是阿扎胞苷,血小板增倍都是獨立的與生存期相關(guān)的預(yù)后因素(中位生存期,24月VS 16月,P=0.025),此外,IPSS評分亦與生存期相關(guān)(P=0.035)。結(jié)論：1、接受去甲基化藥物治療2療程后血小板達(dá)到增倍的患者對去甲基化藥物反應(yīng)好2、接受去甲基化藥物治療2療程后血小板達(dá)到增倍的患者生存時間更長第二部分：地西他濱相關(guān)代謝基因表達(dá)水平在其產(chǎn)生原發(fā)性耐藥及繼發(fā)性耐藥的機(jī)制研究目的：探索接受地西他濱治療的MDS患者代謝基因表達(dá)水平與其產(chǎn)生原發(fā)性耐藥及繼發(fā)性耐藥的關(guān)系。方法：我們選用37例接受地西他濱治療的骨髓增生異常綜合征患者(34例)及急性髓系白血病患者(3例),其中31例患者(包括28例MDS患者及3例AML患者)至少接受了2個療程以上的達(dá)珂規(guī)范治療。在此28例MDS患者中,根據(jù)國際MDS工作組IWG療效標(biāo)準(zhǔn),14例患者接受地西他濱治療有效,14例患者治療無效,即14例患者產(chǎn)生原發(fā)性耐藥。其中,在治療有效的患者中,5例患者達(dá)到不少于8個療程的持續(xù)骨髓完全緩解(continued mCR),5例患者在治療過程中喪失療效或復(fù)發(fā),即5例患者產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥。在此研究中,我們共收集該31例患者的44份骨髓或外周血樣本,27對樣本。其中28份樣本取于該28例MDS患者接受地西他濱治療前,5份樣本取于5例患者復(fù)發(fā)時,5份樣本取于5例持續(xù)骨髓完全緩解患者第八療程時,6份標(biāo)本來自3例AML患者初診時與復(fù)發(fā)時。我們使用QT-PCR方法監(jiān)測此28例患者達(dá)珂治療前的相關(guān)代謝基因(包括hENT1, dCK與CDA)及凋亡基因(BCL2L10)的mRNA水平,從而比較反應(yīng)組與未反應(yīng)組的基因水平。此外,我們繼續(xù)監(jiān)測5例持續(xù)CR患者的第4次mCR后、第8次mCR后及8例復(fù)發(fā)患者(包括另3例復(fù)發(fā)的AML患者)復(fù)發(fā)時的mRNA水平,比較二者基因水平有無差別。結(jié)果：1、在達(dá)珂治療無效的患者中,hENT1基因的表達(dá)水平明顯低于治療有效的患者(P=0.004),而其他基因,包括CDA、DCK及BCL2L10基因表達(dá)水平無明顯差別(CDA,P=0.201; DCK,P=0.687; BCL2L10, P=0.201),這表明hENT1基因表達(dá)水平是MDS患者接受地西他濱治療后產(chǎn)生原發(fā)性耐藥的潛在預(yù)后因子。2、地西他濱的代謝相關(guān)基因(DCK基因,CDA基因,hENT1基因)及凋亡相關(guān)基因(BCL2L10基因)表達(dá)水平在男性、女性分布表達(dá)水平均無差別,分別為96.70±36.3 vs 128.72±36.3 (P=0.157),2048.69±1254.57 vs 1679.65±1555.03 (P=0.295),191.91±66.68 vs 217.75±94.38 (P=0.295) 及 1.19± 1.21 VS 1.45±0.75(P=0.176),這意味著性別與代謝基因表達(dá)分布水平無關(guān)。3、在疾病喪失療效時或復(fù)發(fā)時,DCK基因表達(dá)水平較初診時明顯降低(P=0.012),而其他基因表達(dá)水平,包括CDA基因、hENT1基因及BCL2L10基因表達(dá)水平,與初診時相比較并無明顯差異,P值分別為CDA (P=0.484), hENT1 (P=0.208) 及 BCL2L10(P=0.093),而持續(xù)mCR的患者DCK基因表達(dá)水平較初診時并無明顯差別(P=0.222)。結(jié)論：1、hENT1基因表達(dá)水平是MDS患者接受地西他濱治療后產(chǎn)生原發(fā)性耐藥的潛在預(yù)后因子。2、DCK基因表達(dá)水平是MDS患者及AML患者接受地西他濱治療后產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥的潛在預(yù)后因子。第三部分：TET2、ASXL1基因突變及TP53基因突變與地西他濱產(chǎn)生耐藥的機(jī)制研究目的：探索接受地西他濱治療的MDS患者TET2基因突變及ASXL1基因突變與其療效間的關(guān)系。方法：我們選用53例接受去甲基化治療2療程以上的患者,收集該53例患者治療前的53份骨髓或外周血樣本,進(jìn)行二代測序并分析基因突變結(jié)果,比較TET2基因突變、ASXL1基因突變及TP53基因突變與去甲基化藥物療效的關(guān)系及與患者生存期之間的關(guān)系。結(jié)果：1、53例患者中、接收去甲基化治療有效的患者為29例,總反應(yīng)率為53.7%,其中共有14例患者發(fā)生TET2基因突變,突變發(fā)生率為26.41%,ASXL1基因突變存在于9例患者中,突變發(fā)生率為16.98%,TP53基因突變存在于7例患者中,突變發(fā)生率為。所有突變一例為純合突變,其他均為雜合突變,包括點突變,錯義突變,無義突變,移碼突變,插入突變等。其中,3例患者同時含有TET2基因、ASXL1基因兩種突變,其中1例患者同時含有三種基因突變。2、在這發(fā)生TET2基因突變的14例患者中,7例患者治療有效,7例患者治療無效,無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.620)。而在發(fā)生ASXL1基因突變的9例患者中,2例患者治療有效,7例患者治療無效,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),ASXL1可能是地西他濱治療療效差的一個潛在預(yù)后因子(P=0.075),不過仍需擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步證實。TP53基因突變亦與療效無關(guān)(P=0.174),但生存分析發(fā)現(xiàn)其與患者生存期短密切相關(guān)(P=0.007),而TET2基因突變(P=0.513)及ASXL1基因突變(P=0.110)則與生存期無關(guān)。結(jié)論：1、ASXL1基因突變可能是MDS患者接受去甲基化治療療效較差的因素2、TP53基因突變可能是MDS患者生存期短的預(yù)后因素
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R551.3

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本文編號：1757099