本文選題：Visfatin + 內(nèi)皮祖細(xì)胞��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是Asahara在1997年首次描述的一種來(lái)源于骨髓存在于外周血并且能夠定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。EPCs具有增殖和修復(fù)能力,在機(jī)體血管組織損傷后,EPCs通過(guò)動(dòng)員、遷移、歸巢以及形成毛細(xì)血管網(wǎng)一系列過(guò)程,促進(jìn)血管損傷部位內(nèi)皮再生和修復(fù)。EPCs尚能分泌生長(zhǎng)因子激活血管局部的成熟內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)一步參與血管修復(fù)過(guò)程。目前隨著人們生活方式的改變,糖尿病的發(fā)病率逐年上升,心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的主要死因。研究表明糖尿病患者EPCs數(shù)量減少、功能損傷與心血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),EPCs數(shù)量減少和功能下降被認(rèn)為是心血管疾病的標(biāo)志。EPCs受多種因素的影響,肥胖、高血壓、高血糖、脂代謝紊亂等患者均存在EPCs數(shù)量減少及功能受損。Visfatin由脂肪細(xì)胞分泌。研究發(fā)現(xiàn),visfatin在2型糖尿病患者和代謝綜合征患者體內(nèi),尤其是有動(dòng)脈粥樣硬化病變的患者體內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)。在代謝相關(guān)疾病中visfatin水平變化導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮功能受損,其可能是動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中影響炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。糖尿病患者存在EPCs功能受損,而visfatin是影響血管內(nèi)皮功能的重要因素,我們前期研究發(fā)現(xiàn)visfatin能夠損傷大鼠EPCs遷移、粘附功能,但具體機(jī)制不詳。本研究從EPCs凋亡這一角度探討visfatin損傷EPCs的具體機(jī)制。目的:觀察visfatin對(duì)EPCs凋亡的誘導(dǎo)作用,并探討visfatin誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制。方法:采用密度梯度離心法分離健康分娩婦女臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞,接種到纖維連接蛋白(fiber protein,FN)包被的培養(yǎng)皿中,經(jīng)EMG-2MV(20%胎牛血清,1%青霉素鏈霉素雙抗,0.04%氫化可的松,0.1%肝素,0.1%維生素C,50ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子1,10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子,50ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子,50ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,10μg/ml纖維連接蛋白)重懸,在37℃、5%CO2、濕度95%恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)第7天,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs表面特異性抗原CD34與CD309表達(dá),采用激光共聚焦顯微鏡鑒定EPCs特性。細(xì)胞經(jīng)同步化處理后,第8天隨機(jī)將EPCs分為visfatin不同濃度(0,50,100,150ng/ml)干預(yù)組與抑制劑組。Visfatin不同濃度干預(yù)組孵育EPCs48小時(shí)。抑制劑組分別加上visfatin抑制劑FK866(10μM)與核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)抑制劑BAY11-7085(5μM)孵育EPCs1小時(shí)后,分別加入150ng/ml visfatin孵育EPCs 48小時(shí)。收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,Real-Time PCR檢測(cè)EPCs中天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase 3)、Bax、Bcl-2、NF-κB的m RNA表達(dá)水平,Western Blot檢測(cè)EPCs中caspase 3、Bax、Bcl-2、NF-κB、白細(xì)胞介素-6(inter-leukin-6,IL-6)、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule1,ICAM1)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1 EPCs的分離培養(yǎng)與鑒定分離單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)48小時(shí)后大部分細(xì)胞貼壁,呈鵝卵石樣。以后細(xì)胞逐漸伸展,形態(tài)改變,呈紡錘狀。10天以后部分細(xì)胞聚集成集落樣生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34與CD309雙陽(yáng)細(xì)胞為EPCs。激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)EPCs可以攝取1,1'-二(十八烷基)-3,3',3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸(Di I)乙�；兔芏戎鞍�(Acetylated Low Density Lipoprotein,Ac-LDL)(Di I-Ac-LDL),呈紅色,結(jié)合FITC標(biāo)記荊豆凝集素-1(Ulex europaeus agglutinin-1,UEA-1)(FITC-Lectin-UEA-1),呈綠色,雙染細(xì)胞呈橘黃色。2 Visfatin對(duì)EPCs凋亡的影響:與0 ng/ml組相比,visfatin(50ng/ml,100ng/ml,150ng/ml)呈劑量依賴誘導(dǎo)EPCs凋亡,150ng/ml visfatin組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);caspase 3、Bax m RNA與蛋白表達(dá)升高,150ng/ml visfatin組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),Bcl-2 m RNA與蛋白表達(dá)下降,各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);150ng/ml visfatin組Bax/Bcl-2 m RNA與蛋白比值均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與150ng/ml visfatin組相比,抑制劑FK866干預(yù)組凋亡率下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);caspase 3、Bax m RNA與蛋白表達(dá)、Bax/Bcl-2 m RNA與蛋白比值下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Bcl-2 m RNA與蛋白表達(dá)升高,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3 Visfatin對(duì)EPCs中炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響與0ng/ml組相比,visfatin(50ng/ml,100ng/ml,150ng/ml)組EPCs的IL-6與ICAM1蛋白表達(dá)升高,150ng/ml visfatin組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與150ng/ml visfatin組相比,抑制劑FK866干預(yù)組ICAM1蛋白表達(dá)下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),IL-6蛋白表達(dá)降低,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4 NF-κB在visfatin誘導(dǎo)EPCs凋亡中的作用與0ng/ml組相比,visfatin(50ng/ml,100ng/ml,150ng/ml)組EPCs中NF-κB的m RNA與蛋白表達(dá)升高,150ng/ml visfatin組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與150ng/ml visfatin組相比,BAY11-7085干預(yù)組EPCs凋亡受到抑制,caspase 3、Bax的m RNA與蛋白表達(dá)下降,Bcl-2的m RMA與蛋白表達(dá)升高,ICAM1與IL-6蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1用密度梯度離心法分離的人臍靜脈單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)EMG-2MV培養(yǎng)后,可以分化為CD309、CD34表達(dá)陽(yáng)性的EPCs。2 Visfatin呈劑量依賴誘導(dǎo)EPCs凋亡,上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的m RNA與蛋白表達(dá)。3 Visfatin通過(guò)激活NF-κB通路,誘導(dǎo)EPCs高表達(dá)ICAM1與IL-6炎癥因子,進(jìn)而誘導(dǎo)EPCs產(chǎn)生凋亡,抑制NF-κB通路可以抑制visfatin誘導(dǎo)的EPCs的凋亡反應(yīng)及炎癥因子的表達(dá)。
[Abstract]:Vascular endothelial progenitor cells ( EPCs ) were first described by Asahara in 1997 . The expression of caspase - 3 , Bax , Bcl - 2 , Bax , Bcl - 2 and NF - 魏B in EPCs was detected by flow cytometry . Compared with the 150ng / ml visfatin group , the expression of Bcl - 2 mRNA and protein in EPCs decreased significantly ( P0.05 ) . Compared with the 150ng / ml visfatin group , the expression of Bax / Bcl - 2 mRNA and protein were significantly different ( P0.05 ) . Compared with the 150ng / ml visfatin group , the expression of Bax / Bcl - 2 mRNA and protein were significantly different ( P0.05 ) . Compared with the 150ng / ml visfatin group , the apoptosis of EPCs induced by BAY11 - 7085 was inhibited , and the expression of ICAM - 1 and IL - 6 decreased and the expression of ICAM - 1 and IL - 6 decreased .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R543

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉加遠(yuǎn);5-氮雜-2'-脫氧胞苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化的影響及機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1745399