本文選題：動脈粥樣硬化　切入點(diǎn)：炎癥　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景及目的動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是心血管疾病的主要病理學(xué)變化,也是心血管疾病致死的主要原因。臨床血清學(xué)診斷動脈粥樣硬化的傳統(tǒng)指標(biāo)包括檢測血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白(Highh density protein, HDL)和低密度脂蛋白(Low density protein, LDL)等。然而動脈粥樣硬化是一種涉及多種病因、多種生理病理變化的慢性復(fù)雜性疾病,除上述檢測指標(biāo)提示的脂質(zhì)浸潤狀況外,還包括其它病理生理致病因素,如血管內(nèi)皮功能異常、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖/凋亡以及血小板激活-凝血反應(yīng)等。近年研究發(fā)現(xiàn),某些疾病標(biāo)記物如C-反應(yīng)蛋白(CRP,C-reactive protein)可出現(xiàn)在動脈粥樣硬化疾病的全過程,而某些標(biāo)記物只在疾病特定階段表達(dá)產(chǎn)生,如細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1, Intracellular adhesion molecule-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1, Monocyte-chemokine protein-1)、血清淀粉樣蛋白A(SAA, Serum amyloid A)、金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs, Matrix Metalloproteinases)、髓過氧化物酶(MPOMyeloperoxtidase)以及與血栓形成相關(guān)的纖維蛋白原和可溶性CD40L等,其中CRP是目前研究最多的動脈粥樣硬化生物標(biāo)記物。CRP主要是在感染、損傷等條件下,由白細(xì)胞介素-6(IL-6, Interleukin-6)誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成。在Ca2+存在下,CRP與受損細(xì)胞結(jié)合,激活補(bǔ)體系統(tǒng),促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成。研究報(bào)道：MCP-1在動脈粥樣硬化動物模型斑塊中大量表達(dá)；抑制MCP-1活性可明顯減少斑塊的形成。妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPPA,Pregnancy associated plasma protein A),是一種由合胞體滋養(yǎng)層合成的糖蛋白,一般用于妊娠期間Down氏綜合征篩查。PAPPA可導(dǎo)致粥樣硬化完整保護(hù)帽破裂,其濃度升高與動脈粥樣硬化密切相關(guān)。此外,近期研究發(fā)現(xiàn)軟骨糖蛋白YKL-40濃度升高也與動脈粥樣硬化相關(guān)。既往有關(guān)動脈粥樣硬化生物標(biāo)記物研究的共同特點(diǎn)是：各自僅針對特定的分子,具有一定局限性。動脈粥樣硬化是一個(gè)多因素參與的病理過程,只有針對整個(gè)系統(tǒng)而不僅僅是單個(gè)分子才有可能發(fā)現(xiàn)更全面、更準(zhǔn)確、更易重復(fù)和標(biāo)準(zhǔn)化的生物標(biāo)記物。因此,在整體水平上探索生物系統(tǒng)組成及其活動規(guī)律的組學(xué)研究‘'omics"顯示重要價(jià)值,可為闡明心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的線索,同時(shí)可以為早期診斷、危險(xiǎn)分型和預(yù)后評估提供新的依據(jù),具有重要理論意義和臨床應(yīng)用前景。但目前有關(guān)疾病蛋白組學(xué)的研究報(bào)道仍然較少,尤其是關(guān)于動脈粥樣硬化的血清蛋白組學(xué)尚未見研究報(bào)道。在不同層次的組學(xué)研究中選擇血清蛋白質(zhì)組具有獨(dú)特優(yōu)勢：一是血清樣本獲取便捷,便于臨床應(yīng)用；二是血清蛋白信息量大：疾病狀態(tài)下機(jī)體多種組織和細(xì)胞分泌的疾病相關(guān)蛋白可以進(jìn)入血液循環(huán),組織細(xì)胞表面蛋白也可“脫落”到周圍環(huán)境而進(jìn)入血液循環(huán),循環(huán)內(nèi)的各類細(xì)胞如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板等都可以分泌或“脫落”多種蛋白；三是血中含有1×106種蛋白質(zhì),含量差別可達(dá)到1010,高度優(yōu)化的去除高豐度蛋白的血清蛋白組學(xué)研究可在一定程度減少研究的復(fù)雜性。本項(xiàng)目利用臨床確診的動脈粥樣硬化患者血清標(biāo)本,將基于基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI/TOF/MS, Matrix-assisted laser desorption ionization/Time of Flight/Mass Spectrum)檢測蛋白組學(xué)方法進(jìn)行改進(jìn),對動脈粥樣硬化血清生物標(biāo)記物進(jìn)行篩選鑒定,為確立臨床可應(yīng)用的動脈粥樣硬化血清生物標(biāo)記物,闡明動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)理提供依據(jù)。近年研究表明,細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶9(CDK9, Cyclin-dependent kinase 9)在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和監(jiān)測促炎反應(yīng)基因的激活中起到關(guān)鍵作用。越來越多的CDK9抑制劑或藥物,如PHA767491、FLA (Flavopiridol)獲得快速研究開發(fā)。盡管如此,在關(guān)于動脈粥樣硬化的炎癥機(jī)制和冠狀動脈粥樣硬化病變的研究中,涉及CDK9的報(bào)道仍然很少。本論文第一部分蛋白組學(xué)研究結(jié)果表明：在冠脈動脈粥樣硬化患者和健康對照血清中,多種蛋白分子表達(dá)存在差異；其中CDK9在冠狀動脈粥樣硬化患者血清中表達(dá)顯著增多。結(jié)合表達(dá)差異程度和新近文獻(xiàn)報(bào)道,我們選擇CDK9作為冠狀動脈粥樣硬化血清標(biāo)記物進(jìn)一步研究的候選分子進(jìn)行重點(diǎn)研究。在論文第二部分,擴(kuò)大樣本,進(jìn)一步驗(yàn)證了CDK9在冠狀動脈粥樣硬化患者血清、外周血單個(gè)核細(xì)胞、單核細(xì)胞及在動脈斑塊組織中的異常高表達(dá)水平。第三部分選擇人單核細(xì)胞急性白血病細(xì)胞系THP-1,利用CDK9抑制劑FLA,初步研究了FLA對炎癥刺激狀態(tài)下的人單核細(xì)胞CDK9同種型表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,并以上述結(jié)果為依據(jù)探討了CDK9參與動脈粥樣硬化炎癥的可能機(jī)制以及CDK9作為冠狀動脈粥樣硬化生物標(biāo)記物的可能性,以期為靶向CDK9診斷和治療冠狀動脈粥樣硬化提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。第一部分利用蛋白組學(xué)方法研究冠狀動脈粥樣硬化血清蛋白標(biāo)記物研究目的優(yōu)化血清蛋白組學(xué)技術(shù)方法,探討動脈粥樣硬化發(fā)病過程中血清蛋白的異常表達(dá)情況。研究方法1、研究對象隨機(jī)選取2012年10月至2014年10月山東省立醫(yī)院及山東大學(xué)齊魯醫(yī)院確診冠心病患者43例,其中男25例,女18例,年齡60±3.3歲。入選病例均符合WHO制定的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇同期健康查體者38例作為健康對照,其中男17例,女21例,年齡58±11.1歲。無動脈粥樣硬化、冠脈血管疾病或炎癥性疾��；經(jīng)常規(guī)檢測膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和血糖水平,排除高脂血癥、高血壓、糖尿病。經(jīng)病史詢問、體檢、心電圖檢查和其它生化檢查無異常發(fā)現(xiàn)。本研究由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均知情同意。2、血清收集和血清蛋白的提取處理抽取冠狀動脈粥樣硬化患者或健康對照空腹靜脈血5毫升,分離血清。經(jīng)Albumin and IgG Removal Kit操作處理,去除白蛋白和IgG等血清高豐度蛋白。經(jīng)ReadyPrepTM 2-D Clean-up Kit(二維清除試劑盒)操作處理,清除血清樣本中的鹽類、脂類、核酸等干擾物質(zhì)。隨后收集上清液,將約300μg的蛋白質(zhì)重懸在尿素水化液中。3、蛋白等電聚焦(IEF)將IPG干膠條(pH3-10, NL:18cm, ImmobilineTM DryStrip)條槽置于水平板上,加入樣本尿素水化液,然后滴加Dry Strip覆蓋液覆蓋,加蓋封閉。沿電極平行方向?qū)⒛z條槽置于IPGphor電極板上,按照要求設(shè)置血清樣本電壓程序。蛋白等電聚焦測量儀器為Ettan IPGphorTM。4、蛋白二維電泳(2-DE)蛋白等電聚焦后,經(jīng)12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將IPG膠條中的蛋白進(jìn)行分離。在實(shí)驗(yàn)中使用的電泳參數(shù)是：5W/膠,40分鐘；然后調(diào)整為15W/膠,直至完成。然后,對SDS-PAGE膠進(jìn)行銀染色,利用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像,通過2D-PDQuest圖像分析軟件對圖像中的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析,對感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定位。5、膠內(nèi)酶解用硅烷化處理過的加樣槍頭,從蛋白二維電泳膠上分別切取豐度不同的蛋白點(diǎn),采用改進(jìn)的膠內(nèi)酶解流程酶解處理,最后收集得到蛋白樣本。6、質(zhì)譜分析(MS)將膠內(nèi)酶解得到的蛋白樣本尿素水化溶解液1.5μL,點(diǎn)滴于樣品靶板上,室溫干燥后,取1μL基質(zhì)覆蓋于樣品上。待基質(zhì)完全結(jié)晶后,把樣品靶板放入質(zhì)譜儀檢測。采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)進(jìn)行酶解產(chǎn)物鑒定。采集數(shù)據(jù)的條件和模式：反射模式、正離子譜測定,自動獲取數(shù)據(jù)。首先用質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(Mass Standards Kit for the 4700 Proteomics Analyzer)的酶解肽段外標(biāo)校正儀器,離子延遲提取100m,質(zhì)譜信號累加500次的單次掃描,激光頻率為20.0赫茲(Hz),基質(zhì)和樣品的多肽質(zhì)譜指紋譜質(zhì)量掃描范圍是100-3000u。7.數(shù)據(jù)分析及處理利用Mascot軟件,對所得質(zhì)譜數(shù)據(jù),通過NCBI Human蛋白數(shù)據(jù)庫檢索可與之相匹配的蛋白；根據(jù)檢索結(jié)果廣泛查閱文獻(xiàn),結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和蛋白質(zhì)凝膠上的等電點(diǎn)和分子量,鑒定所檢測到的蛋白質(zhì)種類。研究結(jié)果1、成功優(yōu)化了血清蛋白組學(xué)研究策略：1.1去除血清樣本中的高豐度蛋白和去鹽去雜質(zhì)鑒于血清白蛋白和免疫球蛋白約占血清總蛋白的90%,而疾病血清蛋白標(biāo)記物通常為低豐度蛋白,高豐度蛋白可嚴(yán)重干擾低豐度蛋白的探測,因此本論文利用Albumin and IgG Removal Kit (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA),成功去除了血清樣本中白蛋白和免疫球蛋白IgG兩種高豐度蛋白,從而為探測疾病相關(guān)低豐度蛋白建立了基礎(chǔ)。由于樣本中的鹽類、脂類、核酸及雜質(zhì)等嚴(yán)重干擾蛋白質(zhì)組學(xué)分析,本論文利用ReadyPrepTM 2-D Clean-up Kit,對血清樣本進(jìn)行處理,有效清除了鹽類、脂類、核酸及雜質(zhì)等干擾物質(zhì),增加了檢測靈敏度。1.2多步驟優(yōu)化血清蛋白組學(xué)操作方法在研究過程中,針對血清樣本在去除高豐度蛋白后,二維電泳凝膠圖仍存在蛋白點(diǎn)數(shù)少,出現(xiàn)橫紋、垂直條紋等問題,本文在上樣的蛋白量、SDS-PAGE的pH值、SDS濃度條件、IEF電泳條件及程序等方面進(jìn)行了系列探索,經(jīng)2D-clean-up kit去除鹽類、脂質(zhì)、核酸等干擾物質(zhì),改進(jìn)IEF電壓程序和SDS-PAGE條件,最終獲得比較理想的二維電泳圖,蛋白點(diǎn)分離較好。本論文在多個(gè)步驟上改進(jìn)優(yōu)化了血清樣本等電聚焦的電壓程序,改善改進(jìn)了膠內(nèi)酶解的方法及過程,建立了比較簡便快速的血清蛋白組學(xué)研究方法,探索出適宜的血清樣本等電聚焦條件。2.證實(shí)在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中存在異常血清蛋白表達(dá)通過2D PDQuest的蛋白質(zhì)點(diǎn)分析檢測到每患者樣品中有509±31蛋白質(zhì)點(diǎn),每健康對照樣品中有565±29蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過對比分析研究冠狀動脈粥樣硬化患者及健康對照者的血清標(biāo)本凝膠結(jié)果,發(fā)現(xiàn)冠狀動脈粥樣硬化患者和健康對照間存在33種差異表達(dá)蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)點(diǎn)分別從二維凝膠中切取,進(jìn)行膠內(nèi)酶解,涂板后進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析。通過Mascot多肽指紋識別系統(tǒng),按照蛋白質(zhì)名稱、NCBI編號、理論分子量和pI值,成功識別出27種差異表達(dá)蛋白質(zhì)。在所識別的27種差異表達(dá)蛋白質(zhì)中,與對照組相比,在動脈粥樣硬化患者血清樣本中有15種蛋白質(zhì)表達(dá)升高,包括細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶9(CDK9,Cycin-dependent Kinase 9),而另外12種蛋白質(zhì)則表達(dá)降低。3.所識別差異蛋白質(zhì)的功能分類根據(jù)已經(jīng)確定或推測的功能和細(xì)胞信號通路,將全部27種確定的蛋白質(zhì)進(jìn)一步劃分為6個(gè)不同功能組別,包括細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白、炎癥因子相關(guān)蛋白、免疫因子相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、信號通路相關(guān)分子和其它分子如血管緊張素Ⅱ受體等。在所發(fā)現(xiàn)的疾病高表達(dá)蛋白質(zhì)分子中,CDK9明顯高表達(dá)。參照近期報(bào)道的相關(guān)領(lǐng)域研究進(jìn)展,CDK9與腫瘤、炎癥和心肌肥大等疾病密切相關(guān),本文選擇了CDK9作為動脈粥樣硬化的可能血清生物標(biāo)記物作為下一步重點(diǎn)研究的目標(biāo)分子。第二部分CDK9在冠狀動脈粥樣硬化疾病中的表達(dá)狀況研究研究目的進(jìn)一步探討CDK9在冠狀動脈粥樣硬化患者血清、單核細(xì)胞和冠狀動脈粥樣硬化斑塊組織中的表達(dá)水平,為CDK9作為動脈粥樣硬化血清標(biāo)記物并以CDK9靶向診斷和治療冠狀動脈粥樣硬化疾病提供依據(jù)。研究方法1.研究對象同第一部分。2. Western blot和ELISA檢測血清CDK9表達(dá)水平分離冠狀動脈粥樣硬化患者和健康對照的空腹靜脈血血清。樣本稀釋后做Western Blot檢測血清CDK9蛋白表達(dá)水平；利用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測血清CDK9水平。3.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中CDK9表達(dá)的檢測1)分離PBMCs、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞收集冠狀動脈粥樣硬化患者和健康對照的空腹靜脈抗凝血,通過Ficoll-Hypaque梯度離心方法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),在PBMCs中加Hanks平衡鹽液重新混懸細(xì)胞,進(jìn)一步分離單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。2) RT-PCR檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中CDK9的mRNA表達(dá)分別提取PBMCs、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞總RNA,利用人CDK9的特異引物進(jìn)行RT-PCR,檢測所測細(xì)胞內(nèi)CDK9 mRNA表達(dá)狀況。3) Western Blot檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中CDK9的蛋白表達(dá)狀況分別裂解提取PBMCs、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞總蛋白,樣本經(jīng)10%SDS-PAGE后,利用抗CDK9抗體進(jìn)行Western Blot,檢測不同亞群細(xì)胞內(nèi)CDK9蛋白表達(dá)狀況。4.免疫組化染色及免疫熒光染色檢測冠狀動脈斑塊組織中CDK9/CD14的表達(dá)首先選擇兔動脈粥樣硬化模型,取病變動脈血管組織,常規(guī)石蠟包埋,組織切片,進(jìn)行蘇木精／伊紅(HE)染色和CDK9免疫組化染色。然后選擇臨床病理確診的冠狀動脈粥樣硬化患者動脈斑塊組織,常規(guī)石蠟包埋,組織切片,然后進(jìn)行蘇木精／伊紅(HE)染色、CDK9免疫組化和免疫熒光染色,同時(shí)進(jìn)行單核巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD14的免疫組化染色和免疫熒光染色,確定CDK9和CD14的亞細(xì)胞定位及二者表達(dá)的相關(guān)性。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：利用GraphPad Prism 5軟件(San Diego, CA)處理有關(guān)數(shù)據(jù)。用one-way ANOVA、非配對或配對t檢驗(yàn)分析。連續(xù)型變量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,p0.05視為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.患者血清CDK9高表達(dá)Western Blot結(jié)果表明,在冠狀動脈粥樣硬化患者血清中CDK9表達(dá)明顯升高,與健康對照者相比,p0.01；ELISA結(jié)果顯示,患者血清中CDK9為149.70+105.22 U/L,而健康對照為64.51+25.94 U/L,二者相比有顯著差異,p0.01。2.患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及單核細(xì)胞中CDK9高表達(dá)與健康對照組相比,動脈粥樣硬化患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞,單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中CDK9 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高。二者有顯著差異,尤其是單核細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于健康對照組。兩組中CDK9在外周血單核細(xì)胞亞群中的表達(dá)均高于其在淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá),p0.05。3.動脈粥樣硬化斑塊組織中CDK9明顯高表達(dá)并與CD14表達(dá)正相關(guān)兔動脈粥樣硬化組織HE染色結(jié)果證實(shí),所選組織動脈粥樣硬化斑塊形成,斑塊內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤,CDK9免疫組化染色結(jié)果表明斑塊內(nèi)有CDK9表達(dá)陽性細(xì)胞,陽性部位是細(xì)胞核�；颊邉用}粥樣硬化斑塊組織切片HE染色及CDK9和CD14免疫組化染色結(jié)果顯示：與非斑塊部分組織相比,斑塊組織表現(xiàn)出不規(guī)則的內(nèi)膜增厚、鈣化和明顯的動脈粥樣硬化斑塊形成,伴有明顯的炎性細(xì)胞浸潤。動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜部分CDK9陽性表達(dá),陽性區(qū)主要位于細(xì)胞核內(nèi)。此外,CD14(單核/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志)在斑塊部分陽性染色,提示斑塊部分炎性細(xì)胞多數(shù)是浸潤的單核細(xì)胞。而且免疫熒光染色結(jié)果顯示CD14陽性染色細(xì)胞的CDK9表達(dá)水平增高,二者明顯正相關(guān),結(jié)果進(jìn)一步提示CDK9在動脈粥樣硬化病變浸潤的單核細(xì)胞中具有重要作用。第三部分 CDK9對動脈粥樣硬化炎癥中單核細(xì)胞影響的初步研究研究目的研究炎癥因子刺激下,抑制CDK9后對單核細(xì)胞CDK9表達(dá)、增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響。研究方法1.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及處理人單核細(xì)胞急性白血病細(xì)胞系(THP-1)購于美國ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA),山東大學(xué)藥學(xué)院張彩教授惠贈,本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代培養(yǎng),液氮中保存。將活化的人THP-1細(xì)胞置于含有10%胎牛血清(FBS),100μg/mL的鏈霉素,100u/mL的青霉素的完全RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。分別加入TNFa 50ng/mL,FLA 50nM或100nM,TNFa 50ng/mL+FLA 100nM及RPMI培養(yǎng)液對照,5%CO2,37℃培養(yǎng)6h或/和24h后進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)。2. RT-PCR:同第二部分3. Western blot:同第二部分4.CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖：采用Cell Counting Kit-8,按說明書操作。5.細(xì)胞周期測定：采用Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit,按說明書操作。6.細(xì)胞凋亡檢測：采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,按說明書操作。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：利用GraphPad Prism 5 (San Diego, CA)處理有關(guān)數(shù)據(jù)。連續(xù)型變量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用one-way ANOVA、非配對或配對t檢驗(yàn)分析。p0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.FLA可明顯抑制TNFa-介導(dǎo)的THP-1表達(dá)同種型CDK943RT-PCR及Western Blot檢測結(jié)果提示,未刺激的THP-1細(xì)胞亦有CDK9表達(dá)；加入FLA100 nM處理6h/24h后,THP-1細(xì)胞CDK9表達(dá)受到明顯抑制；在TNFa刺激下,FLA的這種抑制作用更為顯著,與對照組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,p0.05。為探討THP-1細(xì)胞CDK9兩種同種型CDK955和CDK943表達(dá)影響是否存在差異,本文在培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞中加入TNFa和／或FLA100nM處理6h,然后進(jìn)行兩種同種型的Western Blot分析,結(jié)果顯示,在TNFa刺激下,FLA抑制CDK943的作用更加明顯,而CDK955同種型表達(dá)量極少,且在TNFa和／或FLA作用下變化趨勢不明顯,提示TNFa刺激下的單核細(xì)胞的CDK943同種型表達(dá)發(fā)生變化,而CDK955同種型無明顯變化。2.抑制CDK9可明顯抑制TNFa介導(dǎo)的THP-1單核細(xì)胞增殖利用CDK9抑制劑FLA 100nM處理人單核細(xì)胞急性白血病細(xì)胞系THP-1細(xì)胞6h和24h,然后用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖狀況,結(jié)果顯示,FLA單獨(dú)處理或在TNFa存在下6h和24h,THP-1細(xì)胞的增殖均可受到明顯抑制,高濃度FLA作用更加明顯。3.抑制CDK9可明顯導(dǎo)致TNFa介導(dǎo)的THP-1單核細(xì)胞G2/M期阻滯流式細(xì)胞分析結(jié)果表明100nMFLA處理THP-1細(xì)胞6h,可導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯(G2/M期細(xì)胞百分比從10.9%升至12.6%),在TNFa刺激下,100nM FLA處理可以使G2/M期細(xì)胞百分比達(dá)到15.2%,而G0/G1或S期細(xì)胞百分比無顯著變化。4.抑制CDK9可明顯促進(jìn)TNFa介導(dǎo)的THP-1單核細(xì)胞凋亡FLA 50和100nM處理THP-1細(xì)胞6h后,AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,THP-1細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡均明顯增加,p0.05。尤其是在TNFa刺激下,這種作用更加顯著。5.抑制CDK9可明顯促進(jìn)TNFa介導(dǎo)的THP-1單核細(xì)胞促凋亡蛋白表達(dá)FLA 100nM處理THP-1細(xì)胞6h及24h后,Western Blot分析Bcl-2,Bax表達(dá)狀況,結(jié)果表明FLA 100nM處理24h,Bax表達(dá)明顯增加,而Bcl-2改變不明顯；在TNFa刺激下這種作用更加顯著。全文結(jié)論：本論文利用2DE-MALDI-TOF/MS蛋白組學(xué)技術(shù),對比研究冠狀動脈粥樣硬化患者及健康對照者的血清蛋白差異表達(dá),并進(jìn)一步驗(yàn)證候選蛋白細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶9(CDK9)與動脈粥樣硬化疾病的相關(guān)性,取得以下創(chuàng)新性成果：1.成功識別冠狀動脈粥樣硬化患者血清存在的異常蛋白表達(dá)譜；與健康對照者血清相比,有27種差異表達(dá)蛋白。按照功能可將其分為6類,主要與炎癥、免疫細(xì)胞和細(xì)胞信號通路等有關(guān)。2.在識別的血清差異表達(dá)蛋白中,深入研究證實(shí)了CDK9在冠狀動脈粥樣硬化患者血清、外周血單個(gè)核細(xì)胞、單核細(xì)胞和動脈粥樣硬化斑塊組織中表達(dá)明顯增高。冠狀動脈粥樣硬化斑塊組織內(nèi)CDK9高表達(dá)與高浸潤性CD14+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞明顯正相關(guān)。3.初步證實(shí)CDK9抑制可以明顯抑制TNFa刺激下的人單核細(xì)胞急性白血病系THP-1細(xì)胞的CDK943同種型的表達(dá),抑制細(xì)胞增殖,導(dǎo)致TNFa刺激下的單核細(xì)胞的細(xì)胞周期G2/M期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡及促凋亡蛋白表達(dá)。本論文通過蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化疾病血清CDK9高表達(dá),并驗(yàn)證該病患者血清,外周血細(xì)胞,動脈斑塊組織中都存在CDK9高表達(dá),提示CDK9在冠狀動脈粥樣硬化的致病過程中可能具有重要意義,有望成為潛在的冠狀動脈粥樣硬化新的血清標(biāo)記物。本論文結(jié)果為研究冠狀動脈粥樣硬化血管疾病發(fā)病機(jī)理和靶向CDK9診斷治療冠狀動脈粥樣硬化治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),具有重要理論和實(shí)際意義。論文創(chuàng)新點(diǎn)1.通過蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了冠狀動脈粥樣硬化患者和健康對照者血清蛋白的差異表達(dá)譜,獲得27種差異蛋白并將其功能歸類。2.研究證實(shí)CDK9在冠狀動脈粥樣硬化患者血清、外周血單個(gè)核細(xì)胞,尤其是單核細(xì)胞中高表達(dá)。另外,還發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化斑塊組織中CDK9亦高表達(dá),且與局部CD14高表達(dá)明顯相關(guān)。結(jié)果表明：CDK9可能是冠狀動脈粥樣硬化重要的生物標(biāo)記物。3.研究發(fā)現(xiàn)：通過抑制CDK9表達(dá),可以抑制TNFa刺激下的人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞CDK943同種型的表達(dá),抑制細(xì)胞增殖,導(dǎo)致G2/M期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡及促凋亡蛋白的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1696975