本文選題：微小RNA　切入點：EB病毒　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分：病毒miRNA調(diào)控巨核細胞發(fā)育的研究目的：研究病毒ebv-miR-BART6-3p對巨核細胞增殖及分化發(fā)育的影響,并探討其可能的機制。方法：(?)收集20例臍血單個核細胞分離CD34+造血祖細胞擴增為巨核細胞。(?)構(gòu)建ebv-miR-BART6的表達載體,轉(zhuǎn)染入CD34+造血祖細胞定向培養(yǎng)巨核細胞。(?)應(yīng)用流式細胞儀、免疫組織化學(xué)染色分析各組CD41陽性率差異,鑒定巨核細胞。(?)應(yīng)用倒置顯微鏡下觀察巨核細胞集簇形態(tài),吉姆薩染色光鏡分析巨核細胞形態(tài)學(xué)變化,透射電鏡分析巨核細胞超微結(jié)構(gòu)差異。(?)應(yīng)用甲基纖維素混合MegaCult-C培養(yǎng)巨核細胞集落,檢測各組巨核細胞分化能力。(?) QRT-PCR法分析各組miR-185表達差異。(?) Target scan預(yù)測分析miR-185下游靶標(biāo)為ABCG4,熒光素酶實驗證實miR-185下游靶標(biāo)為BCG4.(?) QRT-PCR和WB分析ebv-miR-BART6對ABCG4基因mRNA和蛋白表達的影響。結(jié)果：(?)構(gòu)建病毒ebv-miR-BART6-3p載體,將病毒miRs載體及空白載體(陰性對照)均轉(zhuǎn)染入臍血單個核細胞分離CD34+造血祖細胞定向擴增為巨核細胞,以未處理組為空白對照。流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染率超過75%。流式細胞儀分析三組巨核細胞CD41表達率發(fā)現(xiàn),ebv-miR-BART6-3p轉(zhuǎn)染組CD41陽性細胞率為21.4±5.71%,而空白對照組為36.2±4.09%,陰性對照組為32.7±6.83%。免疫組織化學(xué)法分析三組巨核細胞CD41表達率為ebv-miR-BART6-3p轉(zhuǎn)染組CD41陽性細胞率為17.3±8.33%,而空白對照組為33.7±±6.27%,陰性對照組為30.3±5.83%。吉姆薩分析巨核細胞形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn),空白對照和陰性對照組巨核細胞胞體巨大,胞核不規(guī)則,發(fā)育成熟。而ebv-miR-BART6-3p組小巨核細胞為主。透射電鏡結(jié)果顯示兩對照組板障結(jié)構(gòu)明顯多于ebv-miR-BART6-3p組。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。巨核細胞集簇實驗顯示,ebv-miR-BART6-3p組每個集簇細胞數(shù)為4.6±2.2 cells/colony而空白對照組為16.3±3.7 cells/colony陰性對照組為14.7±4.3 cells/colony,接種1000個細胞在6孔板內(nèi),空白對照組生產(chǎn)克隆數(shù)為483±51,陰性對照組為407±47而ebv-miR-BART6-3p組為217±33。(?) QRT-PCR分析顯示ebv-miR-BART6-3p下調(diào)巨核細胞]miR-185-5p的表達0.323±0.034 vs 0.953±0.097(陰性對照),空白對照組標(biāo)準化為1。(?) miR-185-5p種子序列有2個結(jié)合ABCG4基因3`UTR區(qū)的位點,熒光素酶實驗分析結(jié)果顯示雙靶標(biāo)野生型ABCG4熒光素酶活性下降為0.317±0.127,單獨突變位點1后熒光活性為0.63±0.105,單獨突變位點2一個活性為0.767±0.151,雙位點突變后熒光活性為0.91±0.096。(?) QRT-PCR分析ebv-miR-BART6-3p轉(zhuǎn)染后ABCG4表達上調(diào)為3.327±0.687 vs1.033±0.126(陰性對照),空白對照組標(biāo)準化為1。WB分析顯示ABCG4蛋白表達也顯著高于對照組。結(jié)論：(?) ebv-miR-BART6-3p抑制巨核細胞增殖、分化。(?) ebv-miR-BART6-3p下調(diào)巨核細胞miR-185-5p表達,進而使后者靶標(biāo)ABCG4表達升高。第二部分：hsa-miR-146參與巨核細胞增殖及其與ITP預(yù)后相關(guān)性的研究目的： 證實hsa-miR-146參與巨核細胞增殖并與ITP預(yù)后密切相關(guān)方法：(?)收集10例臍血單個核細胞分離CD34+造血祖細胞擴增為巨核細胞,根據(jù)參考文獻選定濃度為10uM達沙替尼處理。(?)應(yīng)用流式細胞儀分析各組CD41陽性率差異,鑒定巨核細胞。(?)應(yīng)用吉姆薩染色光鏡分析巨核細胞形態(tài)學(xué)變化,透射電鏡分析巨核細胞超微結(jié)構(gòu)差異。(?)應(yīng)用miRNA芯片分析達沙替尼處理前后巨核細胞miRs的表達變化。對比前期ITP患者血漿及AB正常血漿孵育巨核細胞niRs表達譜,通過聚類分析發(fā)現(xiàn)8種hsa-miRs差異在2.5倍以上。(?)收集10例ITP患者血漿,QRT-PCR法驗證芯片結(jié)果,發(fā)現(xiàn)miR-146最為穩(wěn)定,擴大ITP患者例數(shù)為56例,分析其動態(tài)變化與預(yù)后相關(guān)性。結(jié)果：(?)達沙替尼促進巨核細胞增殖及分化,但抑制血小板生成。流式細胞儀檢測達沙替尼組CD41表達率為40.8±3.22%,對照組為32.6±4.71%。免疫組織化學(xué)法分析兩組巨核細胞CD41表達率,對照組CD41陽性細胞率為31.28±5.67%,達沙替尼組為38.92±6.23%。吉姆薩分析巨核細胞形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn),對照組巨核細胞胞體巨大,胞核不規(guī)則,發(fā)育成熟,細胞周圍有比較成熟的血小板成簇分布。達沙替尼組巨核細胞體積接近正常對照組,胞核也不規(guī)則,胞漿較為豐富,胞漿內(nèi)僅有少許不成熟巨大血小板顆粒。透射電鏡結(jié)果顯示對照組板障結(jié)構(gòu)明顯多于達沙替尼組。巨核細胞集簇實驗顯示,接種1000個細胞在6孔板內(nèi),對照組生產(chǎn)克隆數(shù)為447±69,達沙替尼組為527±39。(?)達沙替尼用藥與否的巨核細胞miRs芯片與ITP患者血漿或正常AB血漿孵育巨核細胞miRs芯片聚類分析發(fā)現(xiàn)8個hsa-miRs表達差異均在2.5倍以上。(?)收集ITP患者血漿,QRT-PCR驗證芯片結(jié)果,miR-146與ITP疾病進展密切相關(guān)。結(jié)論：(?)達沙替尼促進巨核細胞增殖、抑制產(chǎn)板,上調(diào)miR-146表達。(?)miR-146與ITP預(yù)后密切相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R558.2

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本文編號：1685095