發(fā)布時(shí)間：2018-03-30 08:22

  本文選題：微小RNA　切入點(diǎn)：EB病毒　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分：病毒miRNA調(diào)控巨核細(xì)胞發(fā)育的研究目的：研究病毒ebv-miR-BART6-3p對(duì)巨核細(xì)胞增殖及分化發(fā)育的影響,并探討其可能的機(jī)制。方法：(?)收集20例臍血單個(gè)核細(xì)胞分離CD34+造血祖細(xì)胞擴(kuò)增為巨核細(xì)胞。(?)構(gòu)建ebv-miR-BART6的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染入CD34+造血祖細(xì)胞定向培養(yǎng)巨核細(xì)胞。(?)應(yīng)用流式細(xì)胞儀、免疫組織化學(xué)染色分析各組CD41陽(yáng)性率差異,鑒定巨核細(xì)胞。(?)應(yīng)用倒置顯微鏡下觀察巨核細(xì)胞集簇形態(tài),吉姆薩染色光鏡分析巨核細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,透射電鏡分析巨核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)差異。(?)應(yīng)用甲基纖維素混合MegaCult-C培養(yǎng)巨核細(xì)胞集落,檢測(cè)各組巨核細(xì)胞分化能力。(?) QRT-PCR法分析各組miR-185表達(dá)差異。(?) Target scan預(yù)測(cè)分析miR-185下游靶標(biāo)為ABCG4,熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-185下游靶標(biāo)為BCG4.(?) QRT-PCR和WB分析ebv-miR-BART6對(duì)ABCG4基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：(?)構(gòu)建病毒ebv-miR-BART6-3p載體,將病毒miRs載體及空白載體(陰性對(duì)照)均轉(zhuǎn)染入臍血單個(gè)核細(xì)胞分離CD34+造血祖細(xì)胞定向擴(kuò)增為巨核細(xì)胞,以未處理組為空白對(duì)照。流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率超過(guò)75%。流式細(xì)胞儀分析三組巨核細(xì)胞CD41表達(dá)率發(fā)現(xiàn),ebv-miR-BART6-3p轉(zhuǎn)染組CD41陽(yáng)性細(xì)胞率為21.4±5.71%,而空白對(duì)照組為36.2±4.09%,陰性對(duì)照組為32.7±6.83%。免疫組織化學(xué)法分析三組巨核細(xì)胞CD41表達(dá)率為ebv-miR-BART6-3p轉(zhuǎn)染組CD41陽(yáng)性細(xì)胞率為17.3±8.33%,而空白對(duì)照組為33.7±±6.27%,陰性對(duì)照組為30.3±5.83%。吉姆薩分析巨核細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照和陰性對(duì)照組巨核細(xì)胞胞體巨大,胞核不規(guī)則,發(fā)育成熟。而ebv-miR-BART6-3p組小巨核細(xì)胞為主。透射電鏡結(jié)果顯示兩對(duì)照組板障結(jié)構(gòu)明顯多于ebv-miR-BART6-3p組。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。巨核細(xì)胞集簇實(shí)驗(yàn)顯示,ebv-miR-BART6-3p組每個(gè)集簇細(xì)胞數(shù)為4.6±2.2 cells/colony而空白對(duì)照組為16.3±3.7 cells/colony陰性對(duì)照組為14.7±4.3 cells/colony,接種1000個(gè)細(xì)胞在6孔板內(nèi),空白對(duì)照組生產(chǎn)克隆數(shù)為483±51,陰性對(duì)照組為407±47而ebv-miR-BART6-3p組為217±33。(?) QRT-PCR分析顯示ebv-miR-BART6-3p下調(diào)巨核細(xì)胞]miR-185-5p的表達(dá)0.323±0.034 vs 0.953±0.097(陰性對(duì)照),空白對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化為1。(?) miR-185-5p種子序列有2個(gè)結(jié)合ABCG4基因3`UTR區(qū)的位點(diǎn),熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示雙靶標(biāo)野生型ABCG4熒光素酶活性下降為0.317±0.127,單獨(dú)突變位點(diǎn)1后熒光活性為0.63±0.105,單獨(dú)突變位點(diǎn)2一個(gè)活性為0.767±0.151,雙位點(diǎn)突變后熒光活性為0.91±0.096。(?) QRT-PCR分析ebv-miR-BART6-3p轉(zhuǎn)染后ABCG4表達(dá)上調(diào)為3.327±0.687 vs1.033±0.126(陰性對(duì)照),空白對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化為1。WB分析顯示ABCG4蛋白表達(dá)也顯著高于對(duì)照組。結(jié)論：(?) ebv-miR-BART6-3p抑制巨核細(xì)胞增殖、分化。(?) ebv-miR-BART6-3p下調(diào)巨核細(xì)胞miR-185-5p表達(dá),進(jìn)而使后者靶標(biāo)ABCG4表達(dá)升高。第二部分：hsa-miR-146參與巨核細(xì)胞增殖及其與ITP預(yù)后相關(guān)性的研究目的： 證實(shí)hsa-miR-146參與巨核細(xì)胞增殖并與ITP預(yù)后密切相關(guān)方法：(?)收集10例臍血單個(gè)核細(xì)胞分離CD34+造血祖細(xì)胞擴(kuò)增為巨核細(xì)胞,根據(jù)參考文獻(xiàn)選定濃度為10uM達(dá)沙替尼處理。(?)應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析各組CD41陽(yáng)性率差異,鑒定巨核細(xì)胞。(?)應(yīng)用吉姆薩染色光鏡分析巨核細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,透射電鏡分析巨核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)差異。(?)應(yīng)用miRNA芯片分析達(dá)沙替尼處理前后巨核細(xì)胞miRs的表達(dá)變化。對(duì)比前期ITP患者血漿及AB正常血漿孵育巨核細(xì)胞niRs表達(dá)譜,通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)8種hsa-miRs差異在2.5倍以上。(?)收集10例ITP患者血漿,QRT-PCR法驗(yàn)證芯片結(jié)果,發(fā)現(xiàn)miR-146最為穩(wěn)定,擴(kuò)大ITP患者例數(shù)為56例,分析其動(dòng)態(tài)變化與預(yù)后相關(guān)性。結(jié)果：(?)達(dá)沙替尼促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖及分化,但抑制血小板生成。流式細(xì)胞儀檢測(cè)達(dá)沙替尼組CD41表達(dá)率為40.8±3.22%,對(duì)照組為32.6±4.71%。免疫組織化學(xué)法分析兩組巨核細(xì)胞CD41表達(dá)率,對(duì)照組CD41陽(yáng)性細(xì)胞率為31.28±5.67%,達(dá)沙替尼組為38.92±6.23%。吉姆薩分析巨核細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組巨核細(xì)胞胞體巨大,胞核不規(guī)則,發(fā)育成熟,細(xì)胞周圍有比較成熟的血小板成簇分布。達(dá)沙替尼組巨核細(xì)胞體積接近正常對(duì)照組,胞核也不規(guī)則,胞漿較為豐富,胞漿內(nèi)僅有少許不成熟巨大血小板顆粒。透射電鏡結(jié)果顯示對(duì)照組板障結(jié)構(gòu)明顯多于達(dá)沙替尼組。巨核細(xì)胞集簇實(shí)驗(yàn)顯示,接種1000個(gè)細(xì)胞在6孔板內(nèi),對(duì)照組生產(chǎn)克隆數(shù)為447±69,達(dá)沙替尼組為527±39。(?)達(dá)沙替尼用藥與否的巨核細(xì)胞miRs芯片與ITP患者血漿或正常AB血漿孵育巨核細(xì)胞miRs芯片聚類分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)hsa-miRs表達(dá)差異均在2.5倍以上。(?)收集ITP患者血漿,QRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果,miR-146與ITP疾病進(jìn)展密切相關(guān)。結(jié)論：(?)達(dá)沙替尼促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖、抑制產(chǎn)板,上調(diào)miR-146表達(dá)。(?)miR-146與ITP預(yù)后密切相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R558.2

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本文編號(hào)：1685095