本文選題：機械牽張力　切入點：氧化低密度脂蛋白　出處：《中山大學》2016年博士論文

【摘要】：目的高血壓或者高血脂最終歸屬均為動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),若兩者同時存在時,血管粥樣硬化發(fā)展更快,其致病機制不十分明了。粥樣硬化斑塊中泡沫細胞來源主要有血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)和巨噬細胞,在高血壓血管病變中對VSMC已有較多研究,對巨噬細胞研究報道卻很少。本課題通過研究氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)、機械牽張力(stretch stress,SS)單獨或共同存在時對巨噬細胞絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、氧化應激反應及細胞的增殖與凋亡以及DNA甲基化的影響,從全新的角度闡述高血壓合并高血脂協(xié)同促進血管重塑的致病機制。實驗方法1.用高速離心法分離血漿脂蛋白LDL(native LDL,nLDL),加硫酸銅對其進行氧化獲得oxLDL;用油紅染色和MTT法鑒定nLDL和oxLDL。2.Western blot檢測nLDL、oxLDL和/或機械力作用RAW264.7細胞后,細胞內(nèi)的MAPKs磷酸化水平的改變。3.辛伐他汀(Simvastatin,SIM)預處理RAW264.7細胞,Western blot檢測其 對oxLDL和/或機械牽張力引起的細胞MAPKs磷酸化的影響。4.辛伐他汀、oxLDL和機械牽張力共同作用于RAW264.7細胞,用免疫熒光法檢測細胞增殖(Ki-67)及凋亡(TUNEL)情況。5.應用辛伐他汀預處理RAW264.7細胞,用免疫熒光的方法檢測oxLDL和/或機械牽張力引起的細胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生情況。6.應用NADPH氧化酶抑制劑(羅布麻寧)預處理細胞,用免疫熒光的方法檢測oxLDL和/或機械牽張力引起的細胞ROS的產(chǎn)生情況。7.體外分離C57BL/6J小鼠主動脈中膜,用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)VSMCs,并用普通光鏡、Western Blot和免疫熒光的方法進行形態(tài)學與生物化學鑒定。8.辛伐他汀、oxLDL和機械牽張力共同作用于RAW264.7細胞,用免疫熒光法檢測細胞全基因甲基化水平的改變。結果:1.離心后,nLDL與血漿其他成分分界明顯,蛋白定量檢測顯示nLDL濃度較高,油紅染色顯示oxLDL組的RAW264.7細胞內(nèi)吞噬的脂滴明顯比nLDL組多。MTT數(shù)據(jù)分析顯示nLDL、oxLDL均可促進RAW264.7細胞增殖,且oxLDL比nLDL更明顯促進細胞增殖。辛伐他丁可抑制nLDL與oxLDL誘導的細胞增殖。2.機械牽張力和oxLDL單獨作用均可以誘導RAW264.7細胞MAPK激活,且呈時間(0-60min)和濃度(0-100μg/ml)依賴性。50μg/ml oxLDL比同濃度的nLDL更能顯著誘導MAPK激活;當oxLDL和機械牽張力共同作用時,可使細胞MAPK進一步激活,大于任一單獨因素的作用,呈疊加促進效應。3.辛伐汀預處理RAW264.7細胞后,可以抑制oxLDL和/或機械牽張力誘導的細胞MAPK的激活。4.機械牽張力和oxLDL單獨作用均可以誘導RAW264.7細胞增殖和凋亡同時增加,兩者同時作用時具有疊加作用。辛伐他汀可以抑制oxLDL和/或機械牽張力引起的細胞增殖和凋亡同時增加。5.機械牽張力和oxLDL單獨作用均可以誘導RAW264.7細胞ROS水平升高,兩者同時作用時具有疊加促進作用。應用辛伐他汀預處理細胞后,可以抑制 oxLDL和/或機械牽張力誘導的ROS產(chǎn)生。6.應用NADPH氧化酶抑制劑羅布麻寧預處理RAW264.7細胞后,可以抑制機械牽張力和/或oxLDL誘導的細胞的ROS產(chǎn)生。7.原代培養(yǎng)小鼠主動脈中膜組織,7天左右細胞從組織中長出。細胞呈長梭型與谷峰樣外觀。經(jīng)生化鑒定細胞表達平滑肌特異抗原SM-α-actin。8.機械牽張力和oxLDL單獨作用均可以誘導VSMCs DNA甲基化水平降低,當兩者共同作用時,其甲基化水平明顯低于任一單因素的作用,具有疊加促進作用,辛伐他汀可以抑制oxLDL和/或機械牽張力誘導的甲基化水平。結論:1.機械牽張力和oxLDL可分別促進RAW264.7細胞MAPKs磷酸化、ROS升高以及細胞增殖與凋亡,而兩者共同作用時上述作用增強,辛伐他汀可抑制上述效應。2.NADPH氧化酶抑制劑羅布麻寧減少了機械牽張力和oxLDL作用下巨噬細胞ROS的產(chǎn)生。3.機械牽張力和oxLDL可單獨引起VSMCs甲基化水平降低,當兩者共同作用時降低更明顯。辛伐他汀可抑制上述效應。4.該研究結果將進一步為高血壓并發(fā)高血脂的防治研究提供重要的實驗依據(jù)。
[Abstract]:鐩殑楂樿鍘嬫垨鑰呴珮琛，

本文編號：1681428