本文選題：機(jī)械牽張力　切入點(diǎn)：氧化低密度脂蛋白　出處：《中山大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的高血壓或者高血脂最終歸屬均為動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),若兩者同時(shí)存在時(shí),血管粥樣硬化發(fā)展更快,其致病機(jī)制不十分明了。粥樣硬化斑塊中泡沫細(xì)胞來源主要有血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)和巨噬細(xì)胞,在高血壓血管病變中對(duì)VSMC已有較多研究,對(duì)巨噬細(xì)胞研究報(bào)道卻很少。本課題通過研究氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)、機(jī)械牽張力(stretch stress,SS)單獨(dú)或共同存在時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞的增殖與凋亡以及DNA甲基化的影響,從全新的角度闡述高血壓合并高血脂協(xié)同促進(jìn)血管重塑的致病機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法1.用高速離心法分離血漿脂蛋白LDL(native LDL,nLDL),加硫酸銅對(duì)其進(jìn)行氧化獲得oxLDL;用油紅染色和MTT法鑒定nLDL和oxLDL。2.Western blot檢測(cè)nLDL、oxLDL和/或機(jī)械力作用RAW264.7細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的MAPKs磷酸化水平的改變。3.辛伐他汀(Simvastatin,SIM)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞,Western blot檢測(cè)其 對(duì)oxLDL和/或機(jī)械牽張力引起的細(xì)胞MAPKs磷酸化的影響。4.辛伐他汀、oxLDL和機(jī)械牽張力共同作用于RAW264.7細(xì)胞,用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞增殖(Ki-67)及凋亡(TUNEL)情況。5.應(yīng)用辛伐他汀預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞,用免疫熒光的方法檢測(cè)oxLDL和/或機(jī)械牽張力引起的細(xì)胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生情況。6.應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑(羅布麻寧)預(yù)處理細(xì)胞,用免疫熒光的方法檢測(cè)oxLDL和/或機(jī)械牽張力引起的細(xì)胞ROS的產(chǎn)生情況。7.體外分離C57BL/6J小鼠主動(dòng)脈中膜,用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)VSMCs,并用普通光鏡、Western Blot和免疫熒光的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)與生物化學(xué)鑒定。8.辛伐他汀、oxLDL和機(jī)械牽張力共同作用于RAW264.7細(xì)胞,用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞全基因甲基化水平的改變。結(jié)果:1.離心后,nLDL與血漿其他成分分界明顯,蛋白定量檢測(cè)顯示nLDL濃度較高,油紅染色顯示oxLDL組的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)吞噬的脂滴明顯比nLDL組多。MTT數(shù)據(jù)分析顯示nLDL、oxLDL均可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖,且oxLDL比nLDL更明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖。辛伐他丁可抑制nLDL與oxLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。2.機(jī)械牽張力和oxLDL單獨(dú)作用均可以誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞MAPK激活,且呈時(shí)間(0-60min)和濃度(0-100μg/ml)依賴性。50μg/ml oxLDL比同濃度的nLDL更能顯著誘導(dǎo)MAPK激活;當(dāng)oxLDL和機(jī)械牽張力共同作用時(shí),可使細(xì)胞MAPK進(jìn)一步激活,大于任一單獨(dú)因素的作用,呈疊加促進(jìn)效應(yīng)。3.辛伐汀預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞后,可以抑制oxLDL和/或機(jī)械牽張力誘導(dǎo)的細(xì)胞MAPK的激活。4.機(jī)械牽張力和oxLDL單獨(dú)作用均可以誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞增殖和凋亡同時(shí)增加,兩者同時(shí)作用時(shí)具有疊加作用。辛伐他汀可以抑制oxLDL和/或機(jī)械牽張力引起的細(xì)胞增殖和凋亡同時(shí)增加。5.機(jī)械牽張力和oxLDL單獨(dú)作用均可以誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞ROS水平升高,兩者同時(shí)作用時(shí)具有疊加促進(jìn)作用。應(yīng)用辛伐他汀預(yù)處理細(xì)胞后,可以抑制 oxLDL和/或機(jī)械牽張力誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。6.應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑羅布麻寧預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞后,可以抑制機(jī)械牽張力和/或oxLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞的ROS產(chǎn)生。7.原代培養(yǎng)小鼠主動(dòng)脈中膜組織,7天左右細(xì)胞從組織中長(zhǎng)出。細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型與谷峰樣外觀。經(jīng)生化鑒定細(xì)胞表達(dá)平滑肌特異抗原SM-α-actin。8.機(jī)械牽張力和oxLDL單獨(dú)作用均可以誘導(dǎo)VSMCs DNA甲基化水平降低,當(dāng)兩者共同作用時(shí),其甲基化水平明顯低于任一單因素的作用,具有疊加促進(jìn)作用,辛伐他汀可以抑制oxLDL和/或機(jī)械牽張力誘導(dǎo)的甲基化水平。結(jié)論:1.機(jī)械牽張力和oxLDL可分別促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞MAPKs磷酸化、ROS升高以及細(xì)胞增殖與凋亡,而兩者共同作用時(shí)上述作用增強(qiáng),辛伐他汀可抑制上述效應(yīng)。2.NADPH氧化酶抑制劑羅布麻寧減少了機(jī)械牽張力和oxLDL作用下巨噬細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。3.機(jī)械牽張力和oxLDL可單獨(dú)引起VSMCs甲基化水平降低,當(dāng)兩者共同作用時(shí)降低更明顯。辛伐他汀可抑制上述效應(yīng)。4.該研究結(jié)果將進(jìn)一步為高血壓并發(fā)高血脂的防治研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:鐩殑楂樿鍘嬫垨鑰呴珮琛，

本文編號(hào)：1681428