本文選題：醛固酮　切入點：心肌細(xì)胞　出處：《貴州醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:1.研究絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、鈣蛋白酶(calpain)和膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在醛固酮(ALD)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程中的作用,了解calpain、ANXA5、MAPKs之間的調(diào)控關(guān)系,闡明ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵作用機(jī)制。2.觀察氧化苦參堿(OMT)減輕ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷這一保護(hù)作用中MAPKs、calpain和ANXA5表達(dá)的變化,進(jìn)一步闡釋ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制,尋找防治心肌細(xì)胞凋亡的有效作用靶點。3.闡明ANXA5基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓左心室肥厚易感性的關(guān)系,為左心室肥厚的分子機(jī)制提供新的線索。方法:1.采用0.06%胰酶消化、差速貼壁法分離純化1-3d SD新生大鼠心肌細(xì)胞做原代培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定心肌細(xì)胞及其純度。MTT探索ALD損傷心肌細(xì)胞的最佳作用濃度及作用時間。建立ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型,并用MTT法和流式細(xì)胞儀驗證�；蛐酒瑱z查MAPKs、calpain、ANXA5基因表達(dá),Real-time PCR、Western-blotting法檢測calpain1、calpain2、p38、JNK、ERK、ANXA5、p-caspase3的m RNA和蛋白表達(dá)水平。實驗分對照組、ALD組、ALD+anti-calpain1組、ALD+anti-calpain2組、ALD+anti-P38組、ALD+anti-ERK組、ALD+anti-JNK組。對各組細(xì)胞采用Real-time PCR和Western-blotting法檢測calpain1、calpain2、p38、JNK、ERK m RNA和蛋白表達(dá)水平�？笰NXA5干預(yù)ALD誘導(dǎo)的心肌后,Western-blotting法檢測calpain1、calpain2、p38表達(dá)。2.原代心肌細(xì)胞用氧化苦參堿(OMT)干預(yù),分為對照組、ALD組、ALD+L-OMT組(L低劑量,OMT濃度25μg/ml)、ALD+H-OMT組(H高劑量,OMT濃度50μg/ml)、ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組。各組細(xì)胞采用MTT法檢測細(xì)胞凋亡,LDH檢測細(xì)胞毒性,Giemsa染色和HE染色觀察細(xì)胞形態(tài),Real-time PCR和Western-blotting法檢測calpain1、calpain2和p38、ANXA5m RNA和蛋白表達(dá)水平。3.研究對象為貴州省貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院原發(fā)性高血壓患者,共850例。其中包括337例原發(fā)性高血壓伴左心室肥厚患者,513例原發(fā)性高血壓非左心室肥厚患者。所有入選者均進(jìn)行心臟超聲的檢測并采集外周靜脈血。SNa Pshot法檢測實驗對象外周靜脈血中ANXA5基因多態(tài)性,觀察高血壓人群外周靜脈血中ANXA5基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓并發(fā)左室肥厚發(fā)病率之間的關(guān)系。結(jié)果:1.胰酶消化法成功分離培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞并經(jīng)肌鈣蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定顯示心肌細(xì)胞陽性率達(dá)95%以上。用MTT檢測確定ALD最佳濃度為10-5mol/L,最佳作用時間為48小時,此條件下ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡率達(dá)37.8%。10-5mol/L濃度下ALD作用48h后心肌細(xì)胞的基因表達(dá)結(jié)果:較對照組比較ANXA5增高9.63倍,p38增高4.05倍,calpain1、calpain2增高3.31倍和2.16倍,JNK、ERK1/2增高1.43和1.62倍。10-5mol/L濃度下ALD作用48h后心肌細(xì)胞中calpain1、calpain2、p38、p-p38、ANXA5、p-caspase3蛋白表達(dá)增加,m RNA表達(dá)增加(p0.05),JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加不明顯,m RNA表達(dá)增高但差異無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。anti-calpain1干預(yù)ALD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞后,calpain1、calpain2和p38 m RNA水平顯著降低(p0.05),表明calpain1的蛋白及m RNA表達(dá)對calpain2、p38蛋白及m RNA表達(dá)有影響,對ERK1/2、JNK蛋白及m RNA表達(dá)沒有影響;anti-calpain2干預(yù)后,calpain2和p38 m RNA水平顯著降低(p0.05),表明calpain2的蛋白及m RNA表達(dá)對p38蛋白及m RNA表達(dá)有影響,對calpain1、ERK1/2、JNK蛋白及m RNA表達(dá)沒有影響;anti-p38、anti-JNK,anti-ERK干預(yù)后,分別有p38、JNK、ERK1/2 m RNA水平顯著降低(p0.05),表明p38、JNK、ERK1/2的蛋白及m RNA表達(dá)對calpain1、calpain2蛋白及m RNA表達(dá)沒有影響,這三者之間也沒有相互影響。anti-calpain1,anti-calpain2,anti-JNK,anti-ERK,anti-p38干預(yù)ALD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞后,ant-calpain1、ant-calpain2、ant-p38組心肌細(xì)凋亡率較ALD組顯著降低(p0.05),但仍高于對照組(p0.05),表明與ALD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的是calpain1、calpain2和p38。ANXA5抑制劑干預(yù)ALD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中,較ALD組比較calpain1、calpain2蛋白及m RNA表達(dá)無明顯改變,p38蛋白表達(dá)量降低,p38m RNA表達(dá)明顯減低(p0.001),表明ANXA5蛋白及m RNA表達(dá)對p38的蛋白和m RNA表達(dá)有影響,對calpain1、calpain2的蛋白及m RNA表達(dá)沒有影響。2.MTT實驗表明ALD組細(xì)胞存活率值顯著低于對照組(p0.05);ALD+L-OMT組(25μg/ml)和ALD+H-OMT組(50μg/ml)ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組細(xì)胞存活率顯著高于ALD組(p0.05)。LDH外漏實驗結(jié)果提示,ALD組LDH外漏率顯著高于對照組(p0.05);ALD+L-OMT組和ALD+H-OMT組、ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組LDH外漏率值均顯著低于ALD組(p0.05)。心肌細(xì)胞經(jīng)Giemsa染色后,細(xì)胞核被染為藍(lán)紫紅色,細(xì)胞漿染成淡紅色。正常組的細(xì)胞核稍偏、大小適宜呈正常結(jié)構(gòu);ALD組的細(xì)胞肥大、胞核居中;與ALD組比較,ALD+L-OMT組、ALD+H-OMT組、ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組細(xì)胞表面積減小,形態(tài)接近于正常。Western-blotting及Real-time PCR結(jié)果顯示與ALD組比較,ALD+L-OMT組和ALD+H-OMT組、ALD+阿司匹林組和ALD+螺內(nèi)酯組與ALD組calpain1,calpain2和p38、ANXA5蛋白表達(dá)減低,m RNA表達(dá)減低(p0.05)。3.左室肥厚患者中ANXA5SNPs表達(dá)是一項重要的危險因素,ANXA5SNPrs1050606與高血壓左心室肥厚患病易感性有統(tǒng)計學(xué)差異(顯性患者:p=0.008;共顯性患者p=0.006)。此外,也研究也證明在原發(fā)性高血壓左室左室肥厚患者中,ANXA5的M1,M2單體也被證明是危險因素(p=0.022和0.032)。結(jié)論:1.ALD可以通過上調(diào)calpain1、calpain2、ANXA5和p38表達(dá)水平,激活caspase3來誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。calpain、ANXA5與MAPKs之間存在調(diào)控關(guān)系,機(jī)制可能為calpain1、2通過調(diào)控ANXA5來影響p38表達(dá),進(jìn)而影響心肌細(xì)胞凋亡。2.OMT可以通過下調(diào)calpain1、calpain2、ANXA5和p38的表達(dá)水平來減輕心肌細(xì)胞凋亡。calpain1、calpain2、ANXA5和p38可以作為減輕ALD誘導(dǎo)的心肌凋亡、改善高血壓心肌重構(gòu)、延緩心衰進(jìn)程的關(guān)鍵作用靶點。3.ANXA5rs1050606,M1和M2單倍體與貴州原發(fā)性高血壓人群的左心室肥厚顯著相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1644732