本文選題：CD38　切入點：心肌肥大　出處：《南昌大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景與研究目的:心肌肥大是由多種心血管疾病如高血壓、心瓣膜病及心肌炎等引起的一種心臟功能的代償性改變,其主要特征為心肌細胞體積增大、細胞外基質(zhì)增多而誘導的心肌纖維化。臨床上長期持續(xù)性的心肌肥厚是引起心臟衰竭甚至猝死的一個重要原因,然而目前尚無十分有效的防治方法。現(xiàn)有文獻資料表明,多條信號通路參與心肌肥大的調(diào)節(jié),然而調(diào)節(jié)這些通路的分子機制尚未完全闡明。因此,尋找新的介導心肌肥厚的特異性分子及其相關(guān)信號通路,對于進一步闡明心肌肥大的發(fā)生機制,發(fā)現(xiàn)心肌肥大防治的新靶點具有非常重要的理論和臨床意義。在我們的早期研究中,我們發(fā)現(xiàn)CD38基因缺失的小鼠胚胎成纖維細胞對H2O2和缺氧復氧誘導的氧化應(yīng)激損傷具有顯著的保護作用,并證明這種保護作用可能與CD38基因缺失導致SIRT1-FOXO1信號通路激活,進而減輕缺氧復氧誘導的心肌損傷有關(guān)。然而,CD38對心肌肥大中的影響尚無報道。本文旨在探索CD38基因在血管緊張素II(angiotensin II,AngII)誘導小鼠心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機制,從而為心肌肥大的預防與治療提供新的作用靶點與研究思路。實驗方法:1.AngII誘導小鼠心肌肥大模型的制備及其分析:選用10-12周齡的CD38基因缺失小鼠與C57BL/6野生型小鼠進行基因型鑒定,并采用ALZET 2002微滲透泵,以1500ng/kg/day的量,皮下注射AngII 14天制備小鼠心肌肥大模型;Softron BP-98A系統(tǒng)帶尾套管法檢測小鼠血壓;測量小鼠心臟重量和體重,分析小鼠心臟體重比差異;取模型鼠心臟固定,石蠟包埋,3μm切片后,FITC標記的Wheat germ agglutinin染色法檢測心肌細胞的肥大程度;采用天狼星紅、Masson染色法檢測組織細胞的纖維化;Vevo770高分辨率心臟超聲儀檢測小鼠心臟的肥厚程度與心臟收縮功能;檢測小鼠心肌肥大的相關(guān)生化指標。2.離體心肌細胞肥大模型的制備及其分析:1)利用RNAi技術(shù)構(gòu)建CD38敲減H9c2穩(wěn)定細胞系,采用Western blot檢測穩(wěn)定細胞系中CD38的干擾效率;2)體外心肌細胞肥大模型的構(gòu)建:采用不同濃度的AngII處理H9c2細胞,實時定量PCR方法檢測心肌肥大標記分子BNP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異以確認心肌細胞肥大模型的建立;3)心肌肥大生物標記物的檢測:2μmol AngII處理CD38干擾H9c2細胞及其對照組細胞48小時后,瞬時定量PCR法檢測肥大標記分子ANP和BNP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異;4)細胞大小的染色法測定:2μmol Ang II處理CD38干擾H9c2細胞及其對照組細胞48小時后,90%乙醇固定20分鐘,結(jié)晶紫染色;5)細胞氧自由基檢測:2μmol Ang II處理H9c2細胞20分鐘后,活性氧染料H2DCF-DA孵育15分鐘,流式細胞儀檢測其熒光強度。3.心肌肥大信號通路的機制分析:1)Western blot分析AngII處理細胞后,對照組及CD38基因干擾組H9c2中SIRT3表達量;2)Q-PCR分析CD38基因干擾對FOXO3及其下游基因Bcl2、ARC和SOD2轉(zhuǎn)錄的影響;3)Western blot檢測AngII處理細胞后,對照組及CD38基因干擾組H9c2中AKT、ERK及GSK3β蛋白磷酸化。4)2μmol AngII處理CD38干擾H9c2細胞及其對照組細胞20分鐘以Flu-3am染色,熒光倒置顯微鏡檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度變化;5)分離CD38干擾H9c2細胞及其對照組細胞胞核胞漿蛋白,采用Western blot法檢測NFATc4核漿蛋白表達。實驗結(jié)果:1.整體動物水平證明CD38基因缺失對血管緊張素II誘導的小鼠心肌肥大具有顯著的保護作用:1)微滲透皮下注射AngII 14天可使小鼠血壓出現(xiàn)明顯升高,且野生型小鼠組與CD38基因缺失小鼠組并無顯著差異。2)AngII誘導心肌肥大模型14天后,心臟超聲檢測顯示AngII可致小鼠心臟收縮期及舒張期的心室后壁厚度明顯增加,而CD38基因缺失小鼠較野生型小鼠其心肌肥厚程度有所減輕。同時,野生型小鼠的左心室重量與體重比顯著增加,而CD38基因缺失小鼠的增加并不明顯;3)Wheat germ agglutinin染色顯示,模型小鼠的心肌細胞大小均有一定程度增加,且野生型小鼠較CD38基因型缺失小鼠其增加更為顯著。4)天狼星紅和Masson染色顯示小鼠在AngII處理后均出現(xiàn)一定程度的心肌纖維化,而野生型小鼠的心肌纖維化程度較CD38基因缺失小鼠明顯加重。2.離體水平研究表明CD38基因干擾明顯耐受Ang II誘導的H9c2心肌肥大:1)采用RNAi方法成功制備了CD38基因敲減的H9c2穩(wěn)定細胞系,經(jīng)Western blot驗證,其CD38基因蛋白表達量可降低60%以上;2)不同濃度AngII均可誘導心肌細胞肥大標記分子BNP的轉(zhuǎn)錄顯著增加,并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性;3)2μmol AngII處理細胞48小時后,對照組心肌細胞ANP和BNP的表達顯著上升,而CD38干擾組心肌細胞表達量明顯減輕;4)結(jié)晶紫染色顯示AngII可顯著增加對照組H9c2細胞的大小,而CD38干擾可明顯減輕AngII誘導的肥大;5)CD38基因干擾可顯著減輕AngII誘導的H9c2細胞內(nèi)氧自由基升高。3.干擾CD38基因可能通過激活SIRT3-FOXO3信號通路,進而抑制AngII誘導的心肌肥大:結(jié)果顯示,1)干擾CD38基因可明顯促進心肌細胞SIRT3蛋白表達;2)干擾CD38基因可明顯促進FOXO3及其下游Bcl2、ARC和SOD2基因的轉(zhuǎn)錄;3)干擾CD38基因可顯著抑制AngII誘導的AKT、ERK及GSK3β蛋白磷酸化。4.干擾CD38基因可抑制AngII誘導的H9c2心肌細胞內(nèi)鈣釋放和calcineunin-NFATc4信號通路的激活:干擾CD38基因可顯著減輕AngII誘導的胞內(nèi)鈣釋放;2)NFATc4在H9c2細胞中主要表達于細胞核,并且在CD38干擾細胞組中其核表達少于對照組。結(jié)論:1.CD38基因缺失可明顯減輕AngII誘導的整體小鼠心肌肥大及心肌纖維化。2.干擾CD38基因可明顯抑制AngII誘導的離體心肌細胞肥大及氧化應(yīng)激。3.干擾CD38基因可激活心肌細胞的SIRT3-FOXO3信號通路,進而抑制AngII誘導的心肌肥大。4.干擾CD38基因可抑制Ca2+-calcineunin-NFATc4通路,進而抑制AngII誘導的心肌肥大。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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