本文選題：IL-12p35　切入點(diǎn)：單核細(xì)胞　出處：《首都醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景急性心肌梗死(AMI)是指由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起冠狀動(dòng)脈的分支堵塞,導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死的疾病。心肌梗死發(fā)生的早期,心肌細(xì)胞缺血壞死,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)清除壞死的心肌細(xì)胞碎片,促進(jìn)炎癥,導(dǎo)致心臟的損傷;心梗后期,成纖維細(xì)胞激活,分泌的細(xì)胞外基質(zhì)增加,而且未梗死區(qū)的心肌細(xì)胞代償性肥大,血管新生增加、側(cè)支循環(huán)建立,從而產(chǎn)生心臟修復(fù)的能力,而炎癥可以參與到心臟的損傷和修復(fù)兩個(gè)過程。心梗發(fā)生后,炎癥細(xì)胞和炎癥因子浸潤(rùn)增加,白細(xì)胞介素-12(IL-12)作為炎癥因子,主要由巨噬細(xì)胞分泌,并參與多種炎癥性心血管疾病。在心肌梗死的患者中,血清中IL-12的水平顯著升高。但是,IL-12在心梗中發(fā)揮的具體作用和機(jī)制并不清楚。由血管內(nèi)皮細(xì)胞引起的血管新生具有在心梗之后早期階段挽救缺血的心肌的潛力,促血管新生的療法一直被認(rèn)為是治療急性心肌梗死的一種很有前途的治療策略。因此,對(duì)血管生成中的內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)和對(duì)血管內(nèi)皮新的分子靶點(diǎn)的鑒定的全面了解在預(yù)防和治療心肌梗死是必不可少的。IL-12可通過分泌抗血管新生因子IFN-γ和IP-10抑制腫瘤血管新生。但是,IL-12在心梗后血管新生中發(fā)揮的具體作用和機(jī)制并不清楚。我們提出假說:急性心肌梗死通過刺激心臟組織中IL-12p35的表達(dá),調(diào)控單核細(xì)胞血管新生和炎癥相關(guān)的基因的表達(dá),參與影響心臟損傷和心臟修復(fù)的過程。急性心梗發(fā)生后,IL-12p35的缺陷將促進(jìn)浸潤(rùn)的單核細(xì)胞促血管新生和抗炎的特性,并最終影響心臟功能和修復(fù)的病理過程。本研究以IL-12p35基因敲除小鼠為研究對(duì)象,關(guān)注急性心肌梗死觸發(fā)心臟損傷和修復(fù),探討單核細(xì)胞浸潤(rùn)特性改變這一核心環(huán)節(jié),為探明心梗導(dǎo)致心臟損傷和修復(fù)的病理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。目的利用野生型和IL-12p35基因敲除型小鼠復(fù)制急性心肌梗死模型,探討小鼠心梗后心臟損傷和修復(fù)的機(jī)制。我們探討了心梗過程中炎癥因子IL-12p35的表達(dá)情況;利用IL-12p35基因型敲除小鼠和注射IL-12p35中和抗體,研究IL-12p35缺失情況下,急性心梗導(dǎo)致的心臟功能和心臟的重塑的保護(hù)作用;利用RNA-seq的方法,證實(shí)心梗后IL-12p35缺失的單核細(xì)胞在心梗后的炎癥和血管新生中的功能;利用體內(nèi)外的血管新生檢測(cè)和成管實(shí)驗(yàn),明確IL-12p35的抑制血管新生的作用,為尋找有效的臨床干預(yù)措施提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.研究對(duì)象分組:第一部分實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性野生型C57/BL6小鼠40只,IL-12p35基因型敲除小鼠40只。均隨機(jī)分為4組(n=20):野生型小鼠假手術(shù)組;IL-12p35基因型敲除小鼠假手術(shù)組;野生型小鼠手術(shù)組;IL-12p35基因型敲除小鼠手術(shù)組。雄性野生型C57/BL6小鼠10只,進(jìn)行心梗手術(shù)之后,用流式細(xì)胞分選的方法提取心臟細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。第二部分實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性野生型C57/BL6小鼠40只,IL-12p35基因型敲除小鼠40只。均隨機(jī)分為4組(n=20):野生型小鼠假手術(shù)組;IL-12p35基因型敲除小鼠假手術(shù)組;野生型小鼠手術(shù)組;IL-12p35基因型敲除小鼠手術(shù)組。2.小鼠急性心肌梗死模型制備:小鼠用2%異氟烷吸入麻醉,結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支,復(fù)制小鼠急性心肌梗死模型。心梗3天后檢測(cè)炎癥因子IL-12p35的表達(dá),心梗7天后檢測(cè)血管新生情況,心梗4周后檢測(cè)心臟功能和心臟的重塑。3.心梗后IL-12p35的表達(dá):Real-time PCR,Western Blot蛋白免疫印記和免疫熒光法檢測(cè)。4.心功能測(cè)定:使用小動(dòng)物超聲(Visual Sonics Vevo2100)測(cè)量模型制備前小鼠心臟功能;對(duì)心梗模型手術(shù)后小鼠測(cè)其第7天及第28天心功能。5.心臟組織纖維化測(cè)定:采用Masson三色特殊染色方法檢測(cè)組織內(nèi)膠原沉積。6.心肌肥厚的測(cè)定:采用麥胚凝集素(WGA)染色方法檢測(cè)心肌肥厚。7.心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子表達(dá):免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)CD11b+的細(xì)胞在心臟組織中的浸潤(rùn)和Mac-2+的表達(dá)。8.心臟組織中血管新生的檢測(cè):利用免疫組織化學(xué),流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot蛋白免疫印記法檢測(cè)CD31+細(xì)胞的浸潤(rùn)。9.下肢缺血模型制備:野生型和IL-12p35基因敲除型小鼠用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉,于上下游將股動(dòng)脈分別結(jié)扎,并與兩個(gè)結(jié)扎線中間剪短血管,復(fù)制下肢缺血的模型。手術(shù)前后用激光彩色多普勒檢測(cè)下肢血流,若檢測(cè)不到血流提示模型復(fù)制成功。下肢缺血3天,用Real-Time PCR檢測(cè)炎癥因子Mac-2的表達(dá),用免疫組化染色檢測(cè)CD31的表達(dá)情況。10.體外檢測(cè)IL-12對(duì)單核細(xì)胞中血管新生相關(guān)因子和炎癥因子的表達(dá):提取小鼠骨髓單核細(xì)胞,培養(yǎng)3天后,給予重組的IL-12刺激,提取RNA,用Real-Time PCR檢測(cè)單核細(xì)胞中炎癥因子和血管新生相關(guān)因子的表達(dá)。11.臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的成管實(shí)驗(yàn):利用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在缺氧的條件下,重組IL-12對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞成管的作用;利用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與野生型和IL-12敲除型單核細(xì)胞共培養(yǎng),檢測(cè)在缺氧條件下兩種單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞成管的作用,并用免疫熒光的方法染成管的內(nèi)皮細(xì)胞上的v WF的表達(dá),用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察采圖。12.內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn):小鼠用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉,將0.5ml基質(zhì)膠栓子埋入小鼠腹股溝皮下(實(shí)驗(yàn)組:基質(zhì)膠包含未處理的野生型和敲除型單核細(xì)胞,給予或者不給于重組IL-12),7天之后取出,包埋成冰凍組織,冰凍切片進(jìn)行CD31的免疫組化染色。13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)都以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間均數(shù)比較采用oneway ANOVA;兩組之間比較用非配對(duì)的T檢驗(yàn),多組之間比較用one-way ANOVA或者two-way ANOVA,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.急性心肌梗死術(shù)后,野生小鼠心臟組織中,在RNA水平和蛋白水平IL-12p35的表達(dá)均增高;2.心梗術(shù)后的小鼠心臟組織浸潤(rùn)的IL-12p35主要由單核細(xì)胞分泌;3.心梗術(shù)后,與野生型小鼠組相比,IL-12p35敲除型小鼠的存活率增高;4.心梗術(shù)后,與野生型小鼠組相比,IL-12p35敲除型小鼠的心臟功能改善;5.心梗術(shù)后,與野生型小鼠組相比,IL-12p35敲除型小鼠的心臟纖維化減輕、疤痕面積減小;6.在野生型和IL-12p35敲除型小鼠心梗后流式分選出心臟組織中CD11b+細(xì)胞,提取RNA,進(jìn)行RNA-sequencing(RNA測(cè)序),發(fā)現(xiàn)相比野生組,敲除組中差異表達(dá)的基因有1297個(gè)。用GO分析方法來分析這些差異表達(dá)的基因發(fā)現(xiàn),血管新生相關(guān)和炎癥相關(guān)的因子差異最大;7.檢測(cè)心梗后野生型和敲除型小鼠的心臟組織中血管新生因子的表達(dá),敲除組的促血管新生因子增加,而抑制血管新生的因子下降;8.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心梗后野生型和敲除型小鼠的心臟組織中CD31的表達(dá),敲除組的CD31表達(dá)增加;9.利用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)心梗后野生型和敲除型小鼠的心臟組織中CD31的表達(dá),敲除組的梗死區(qū)和交界區(qū)的CD31陽性面積增加;10.利用蛋白印跡方法檢測(cè)心梗后野生型和敲除型小鼠的心臟組織中CD31的表達(dá),敲除組的梗死區(qū)和交界區(qū)的CD31表達(dá)增加;11.利用下肢缺血的模型,驗(yàn)證野生型小鼠和敲除型小鼠的血管新生反應(yīng),和野生組相比,敲除組缺血后1、2和3天后,血流再灌注增加;12.提取野生型小鼠的骨髓單核細(xì)胞,體外給予IL-12刺激,與未處理組相比,IL-12組可抑制單核細(xì)胞血管新生因子表達(dá),促進(jìn)單核細(xì)胞抑制血管新生因子表達(dá);13.利用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn),可見,給予重組IL-12刺激,在缺氧培養(yǎng)的條件下并不能抑制內(nèi)皮細(xì)胞在b-FGF誘導(dǎo)的管腔形成;14.利用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn),在缺氧培養(yǎng)的條件下將野生型和敲除型骨髓單核細(xì)胞分別于內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),可見,與野生型單核相比,敲除型單核細(xì)胞可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成;而且,形成管腔的內(nèi)皮細(xì)胞確實(shí)可以表達(dá)v WF這種內(nèi)皮細(xì)胞的表面Marker;15.利用Matrigel plug實(shí)驗(yàn),基質(zhì)膠分別于野生型和敲除型小鼠的骨髓單核細(xì)胞共同埋入,可見,與野生型相比,當(dāng)膠與敲除型單核細(xì)胞共埋時(shí),CD31陽的細(xì)胞浸潤(rùn)到基質(zhì)膠的數(shù)目增多,而給予重組IL-12后,兩組的CD31陽的細(xì)胞均減少,但敲除組仍比野生組的CD31陽的細(xì)胞多;16.檢測(cè)心梗后野生型和敲除型小鼠的心臟組織中炎癥因子的表達(dá),敲除組的炎癥因子下降;17.提取野生型小鼠的骨髓單核細(xì)胞,體外給予IL-12刺激,與未處理組相比,IL-12組可促進(jìn)單核細(xì)胞炎癥因子表達(dá);18.心梗7天后,IL-12p35敲除組小鼠與野生組小鼠相比,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)單核細(xì)胞表面的標(biāo)志CD11b陽性面積和巨噬細(xì)胞標(biāo)志MAC-2陽性面積明顯下降;19.野生型小鼠心梗手術(shù)前、術(shù)后2、4和6天分別進(jìn)行腹腔注射同型對(duì)照抗體和IL-12的中和抗體,與對(duì)照組相比,中和抗體組的心功能、疤痕面積和間質(zhì)纖維化均減輕,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志CD31、單核細(xì)胞表面的標(biāo)志CD11b和巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志Mac-2的陽性面積明顯下降;結(jié)論1.在急性心肌梗死的模型中,IL-12p35表達(dá)上調(diào),并且IL-12是浸潤(rùn)到心臟組織中的單核細(xì)胞所分泌的;2.在急性心肌梗死的模型中,與野生型小鼠相比,IL-12p35敲除型小鼠的心臟功能改善,心臟重塑和心肌肥厚減輕,IL-12p35參與急性心肌梗死的病理過程;3.CD11b+單核細(xì)胞的RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和q RT-PCR分析顯示,IL-12p35基因敲除型小鼠的心臟與野生型小鼠相比,顯示不同的轉(zhuǎn)錄特性,顯示出促血管生成和抗炎的特性;4.在小鼠下肢缺血模型中,與野生型小鼠相比,IL-12p35基因敲除型小鼠的血管新生增強(qiáng)。此外,成管實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)膠的分析表明,IL-12p35的血管新生的抑制作用依賴于單核細(xì)胞;5.IL-12p35缺失通過減少趨化因子的產(chǎn)生和單核細(xì)胞浸潤(rùn)到心臟來發(fā)揮抑制炎癥的作用。6.IL-12p35的中和抗體限制急性心肌梗死導(dǎo)致的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)同時(shí)促進(jìn)血管新生和心臟功能。綜上所述,本研究結(jié)果表明,急性心肌梗死激活浸潤(rùn)到心臟中的單核細(xì)胞,表達(dá)IL-12p35增多。應(yīng)用IL-12p35的敲除鼠,進(jìn)一步證明了IL-12p35的缺失可以改善心梗后的心臟功能和心臟重塑及纖維化。IL-12p35敲除或者利用中和抗體中和后,心梗后的心臟中血管新生得到改善、炎癥浸潤(rùn)減少。IL-12p35的這種保護(hù)心梗后心臟功能的作用是通過調(diào)節(jié)心梗后單核細(xì)胞的血管新生因子和炎癥因子的表達(dá)。本研究首次證明急性心梗死激活浸潤(rùn)到心臟中的單核細(xì)胞分泌IL-12p35,進(jìn)而IL-12p35抑制單核細(xì)胞分泌血管新生因子,促進(jìn)單核細(xì)胞分泌促炎因子,最終通過調(diào)節(jié)心臟中的血管新生和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心臟功能損傷。同時(shí)還證實(shí)在心梗刺激條件下,IL-12p35參與多種血管新生和炎癥相關(guān)基因的調(diào)控,為今后單核細(xì)胞分化和功能的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為臨床上控制和抑制急性心梗激活下心臟損傷和修復(fù)提供了嶄新的視角。本研究提供新穎的體內(nèi)和體外的證據(jù),表明抑制IL-12p35的表達(dá)可能成為急性心梗導(dǎo)致的靶器官損傷過程中新的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.22

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1 記者 王t，

本文編號(hào)：1622920