本文選題：TAD　切入點(diǎn)：Oct4　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景及目的:急性胸主動脈夾層是一種年發(fā)生率十萬分之六、30天院內(nèi)死亡率47.4%的致死性大血管疾病。近年來,胸主動脈夾層的病因?qū)W研究日益增多,但是迄今為止其發(fā)病機(jī)制仍沒有被徹底闡明。胸主動脈夾層病因?qū)W的深入了解有助于改進(jìn)其治療效果,因此關(guān)于其發(fā)病機(jī)理的研究就顯得十分重要。作為主動脈中層最為重要的細(xì)胞成分以及血管壁內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源,人主動脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)的結(jié)構(gòu)及功能的完整對于維持主動脈壁的正常生物力學(xué)特性尤為重要。大量研究已報(bào)道了HASMC的功能異常與多種主動脈疾病的相關(guān)性。在特定條件下,終末分化的正常HASMC會出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致其生物學(xué)特性出現(xiàn)顯著改變。針對胸主動脈夾層的研究發(fā)現(xiàn),由生理?xiàng)l件下存在的、廣泛表達(dá)α-SMA、SM22α等表型標(biāo)志物基因的“收縮型”HASMC向增殖能力強(qiáng)且表型標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)的“合成型”HASMC轉(zhuǎn)化的過程是許多胸主動脈疾病的早期事件和關(guān)鍵病理學(xué)改變。然而,關(guān)于HASMC表型轉(zhuǎn)化的確切分子機(jī)制仍然不明。Oct4是由POU5f1基因編碼的、POU同源域轉(zhuǎn)錄因子家族的一員。作為細(xì)胞自我更新和多能性的重要調(diào)節(jié)因子,Oct4廣泛表達(dá)于多能性細(xì)胞之中。此外,將Oct4與其他三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)染至原代成纖維細(xì)胞中,能夠誘導(dǎo)其成為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,即i PS細(xì)胞。關(guān)于疾病的研究發(fā)現(xiàn),Oct4可表達(dá)于肺腺癌組織,并可導(dǎo)致其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。腫瘤細(xì)胞可通過EMT過程轉(zhuǎn)化成為具有更強(qiáng)遷移能力和干性特征的惡性癌細(xì)胞。然而,Oct4在血管疾病中的研究卻鮮有報(bào)道。據(jù)我們所知,關(guān)于Oct4在HASMC表型轉(zhuǎn)化及胸主動脈夾層發(fā)病過程中的作用目前尚無報(bào)道。本研究旨在探究Oct4對胸主動脈夾層發(fā)病過程中HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制。研究方法:1.組織標(biāo)本的收集:12例升主動脈夾層組織取自Stanford A型夾層病人。6例正常升主動脈組織取自未患有血管疾病的捐獻(xiàn)者。2.HASMC的原代培養(yǎng):原代人主動脈平滑肌細(xì)胞分離自3例夾層組織和3例正常主動脈組織。小心剝離動脈的內(nèi)膜和中膜后,主動脈中膜被剪成4×4毫米大小的小塊,并接種于24孔板中,每孔1-2個(gè)組織塊。在孔內(nèi)加入300ul含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)基,每周換液兩次。3.免疫組織化學(xué)染色:主動脈切片脫蠟、抗原修復(fù)并抑制內(nèi)源性過氧化物酶后,孵育一抗,然后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,最后采用DAB進(jìn)行顯色。4.免疫熒光染色:福爾馬林固定HASMCs后,依次孵育一抗和熒光二抗。細(xì)胞核用DAPI襯染。5.小RNA干擾及轉(zhuǎn)染:按照Lipofectamine 2000說明書提供的方法轉(zhuǎn)染si RNA至HASMCs中。6.平板劃線:用200ul移液器槍頭在單層細(xì)胞中央劃出一條直線,分別于劃痕后0小時(shí)和24小時(shí)拍照,評價(jià)細(xì)胞遷移能力。7.Western Blot和q RT-PCR分別用于檢測組織和細(xì)胞中蛋白和m RNA的表達(dá)水平。8.熒光素酶報(bào)告基因:野生型和突變型KLF5啟動子區(qū)序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆至p GL3-basic載體質(zhì)粒的熒光素酶基因上游,構(gòu)建p GL3-Pro-WT-KLF5 and p GL3-Pro-MT-KLF5質(zhì)粒。通過PCR方法克隆人類基因組DNA中的Oct4 CDS區(qū)序列,構(gòu)建Oct4過表達(dá)質(zhì)粒,pc DNA-Oct4。采用雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。啟動子活性以海腎熒光素酶活性校正后的細(xì)胞裂解液熒光素酶活性表示。9.染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)采用EZ-Ch IP染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒,仿照試劑盒中提供的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)已均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用非配對t檢驗(yàn),并通過SPSS軟件實(shí)現(xiàn)。p值小于0.05認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果:1.Oct4在來源于TAD病人的主動脈組織和HASMCs中表達(dá)升高。Western blot和q RT-PCR結(jié)果提示,與正常主動脈相比,TAD組織中Oct4的蛋白和m RNA表達(dá)均顯著升高。免疫組織化學(xué)染色提示,TAD患者的主動脈中膜中Oct4表達(dá)上調(diào),且主要定位于HASMCs的細(xì)胞核內(nèi)。細(xì)胞免疫熒光學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TAD患者來源的HASMCs中Oct4熒光明顯,且特異性地定位于細(xì)胞核內(nèi)。相反地,正常對照組細(xì)胞中的Oct4熒光則十分微弱,且在胞漿和胞核中均有分布。本部分結(jié)果提示Oct4可能在調(diào)控HASMCs中與TAD發(fā)病相關(guān)基因的表達(dá)方面發(fā)揮重要作用。2.Oct4能夠誘導(dǎo)HASMCs的去分化表型,并且能夠提高其遷移和增殖能力。Oct4過表達(dá)能夠引起HASMCs中α-SMA和MYH11蛋白及m RNA的表達(dá)下調(diào)。平板劃線結(jié)果提示Oct4的過表達(dá)能夠增強(qiáng)HASMCs的遷移能力。CCK8實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)Oct4的過表達(dá)能夠促進(jìn)HASMCs的增殖。我們的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Oct4的干擾敲低能夠組織TNF-α誘導(dǎo)的α-SMA和MYH11表達(dá)下調(diào)和HASMCs增殖和遷移能力的增強(qiáng)。3.KLF5在TAD病人的主動脈組織中表達(dá)上調(diào),且Oct4通過上調(diào)KLF5的表達(dá)引起HASMCs的表型轉(zhuǎn)化。與轉(zhuǎn)染GFP過表達(dá)腺病毒的HASMCs相比,轉(zhuǎn)染Oct4過表達(dá)腺病毒的HASMCs中Nanog,Sox2,BMP4,Etv5 and KLF5基因的m RNA水平顯著上調(diào),而TDGF1,Nodal and Sfrp1基因的m RNA水平則明顯下降。Western blot結(jié)果提示TAD主動脈中KLF5蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常主動脈組織。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn),KLF5明顯表達(dá)于TAD中膜內(nèi)的HASMCs中,而在正常主動脈中則少有表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果提示Oct4能夠直接與KLF5啟動子區(qū)結(jié)合。進(jìn)一步地,我們分別構(gòu)建了包含野生型KLF5啟動子和模序突變型KLF5啟動子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒——p GL3-Pro-WT-KLF5和p GL3-Pro-MT-KLF5。將Oct4過表達(dá)質(zhì)粒分別于上述兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Oct4能夠顯著激活p GL3-Pro-WT-KLF5熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄,而Oct4結(jié)合位點(diǎn)突變的模序突變型質(zhì)粒則無法被激活轉(zhuǎn)錄。上述結(jié)果提示Oct4能夠與KLF5啟動子區(qū)結(jié)合并激活KLF5的轉(zhuǎn)錄。最后,我們的拯救實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),Oct4介導(dǎo)的HASMCs由收縮型向合成型的轉(zhuǎn)化過程是通過,至少是部分地通過,上調(diào)KLF5的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)論:Oct4在胸主動脈夾層患者的主動脈組織和HASMCs中表達(dá)上調(diào)。Oct4引起的HASMCs由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)化過程是通過直接上調(diào)KLF5的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.1

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本文編號：1622665