發(fā)布時(shí)間：2018-03-14 23:37

  本文選題：MORN4　切入點(diǎn)：NR4A2　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的急性心肌梗死等缺血性心臟病是致死率最高的疾病之一,其發(fā)病機(jī)理是冠狀動(dòng)脈循環(huán)受阻導(dǎo)致供應(yīng)到心臟的血液減少,心肌細(xì)胞由于營(yíng)養(yǎng)缺乏而發(fā)生大量死亡,對(duì)心室造成不可逆的損傷。因此抑制缺血引起的心肌細(xì)胞凋亡,對(duì)于缺血性心臟疾病的治療非常重要。自噬增加是缺血心肌的另一重要病理現(xiàn)象,通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)損傷細(xì)胞器或長(zhǎng)壽蛋白來(lái)維持細(xì)胞生存所需基本能量,因此,適度的自噬對(duì)于細(xì)胞的存活是有益的,但過(guò)度的自噬可能會(huì)引發(fā)細(xì)胞死亡。自噬和凋亡互相聯(lián)系形成復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò),影響自噬與凋亡的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)鞘氨醇磷酸膽堿(Sphingosylphosphorylcholine,SPC)能通過(guò)自噬抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡。SPC是一種生物活性鞘脂類,可以作為有效工具發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞自噬和凋亡關(guān)聯(lián)的新因子。我們利用體外心肌細(xì)胞缺血模型結(jié)合基因芯片技術(shù)研究了 SPC調(diào)控的基因,發(fā)現(xiàn)MORN4及NR4A2受到SPC的調(diào)控,可能是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬和凋亡的重要因子。MORN4(the membrane occupation and recognition nexus repeats 4 times)是包含4個(gè)MORN motif的蛋白。MORN motif廣泛存在于動(dòng)物、植物和原生生物的蛋白中,數(shù)量從2-17不等,但對(duì)其功能所知甚少。研究發(fā)現(xiàn)MORN motif與蛋白的膜定位有關(guān),如 phosphatidylinositol phosphate kinase(PIPK)上的 MORN motif可將其定位在細(xì)胞膜上;而與葉綠體分裂相關(guān)的蛋白accumulation and replication of chloroplast(ARC3)通過(guò)MORN motif定位到類囊體膜上。目前有關(guān)MORN4的報(bào)道更少,僅限于參與果蠅光敏反應(yīng)的研究,MORN4是否在缺血心肌中發(fā)揮功能還不清楚。NR4A2(Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 2)也叫Nurr1,與NR4A1,NR4A3組成NR4A孤核受體家族。NR4A家族屬即早期反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,能夠迅速對(duì)環(huán)境的改變做出反應(yīng)。已有研究表明,NR4A2參與到腫瘤,肥胖,糖尿病,特別是神經(jīng)類疾病的發(fā)生中,但是是否參與缺血性心臟病目前還不清楚。NR4A2在疾病中的功能與其調(diào)控分化,凋亡,遷移,增殖等有關(guān),根據(jù)芯片結(jié)果我們推測(cè)NR4A2可能是參與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子,目前,NR4A1參與細(xì)胞凋亡的研究已有較多報(bào)道,但是NR4A2與NR4A1在DNA結(jié)合區(qū)域和配體結(jié)合區(qū)域的不同使得兩者功能不同,有關(guān)NR4A2的報(bào)道主要集中在肺癌細(xì)胞中,如:NR4A2在肺癌細(xì)胞中通過(guò)與p53結(jié)合抑制Bax的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡。但是NR4A2是否參與心肌細(xì)胞的凋亡尚未見(jiàn)報(bào)道。基于以上問(wèn)題,本論文研究了 MORN4及NR4A2在缺血心肌細(xì)胞自噬與凋亡中的作用,并進(jìn)一步闡明了相關(guān)的作用機(jī)制。本論文的研究結(jié)果為缺血性心臟病的治療提供了新的藥物作用靶點(diǎn)。研究結(jié)果1.SPC通過(guò)JNK/MORN4/MFN2促進(jìn)的自噬抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡1.1 SPC上調(diào)MORN4的表達(dá)去血清處理H9c2心肌細(xì)胞用以模擬心肌缺血的體內(nèi)環(huán)境,并加入SPC檢測(cè)MORN4的變化。Western blot及免疫熒光顯示5 μM SPC明顯上調(diào)MORN4的蛋白水平。熒光定量PCR驗(yàn)證了 5 μM SPC上調(diào)MORN4的RNA水平。因此,SPC能夠上調(diào)MORN4的表達(dá)。1.2 MORN4在缺血心肌細(xì)胞和心梗心臟中的表達(dá)升高為了明確MORN4是否參與心肌細(xì)胞缺血過(guò)程,我們檢測(cè)了 MORN4在缺血心肌中的表達(dá)。Western blot顯示當(dāng)缺血超過(guò)4 h時(shí),伴隨著凋亡maker PARP和caspase3切割的增加,MORN4的表達(dá)也顯著上調(diào)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用急性心梗模型進(jìn)行驗(yàn)證,western blot結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,心梗模型中心臟組織的PARP和caspase3的切割明顯高于對(duì)照組,同時(shí)MORN4的表達(dá)明顯升高。QPCR結(jié)果與蛋白水平變化一致。1.3干擾MORN4促進(jìn)H9c2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞的凋亡為了明確MORN4在缺血心肌細(xì)胞凋亡中的作用,我們利用MORN4的干擾RNA抑制MORN4的表達(dá)。瓊脂糖凝膠電泳,QPCR和免疫熒光結(jié)果表明80 nM的siRNA明顯降低MORN4的表達(dá)。Western blot結(jié)果表明MORN4敲減后H9c2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞凋亡marker PARP與caspase3的切割都增加。TUNEL染色結(jié)果表明干擾MORN4后缺血導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)一步加劇。因此,干擾MORN4促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。1.4干擾MORN4抑制H9c2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞的自噬流我們進(jìn)而利用MORN4的干擾RNA探究MORN4在缺血心肌自噬中的作用。干擾MORN4后,western blot結(jié)果顯示心肌細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白水平明顯升高;熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)入EGFP-LC3的心肌細(xì)胞中LC3點(diǎn)狀聚集明顯增多。為了分析LC3-Ⅱ增多的原因,我們利用了自噬起始的抑制劑3-methyladenine(3MA)及自噬流的阻斷劑bafilomycin A1(Baf A1)。由于3MA和BafA1均沒(méi)有影響LC3-Ⅱ的蛋白水平,表明MORN4的siRNA通過(guò)阻斷缺血心肌細(xì)胞的自噬流導(dǎo)致了 LC3-Ⅱ增多。1.5干擾MORN4通過(guò)阻斷自噬流促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡我們利用自噬流的阻斷劑Baf A1和自噬促進(jìn)劑Rapamycin確認(rèn)MORN4敲減導(dǎo)致的自噬流阻斷與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。Western blot結(jié)果顯示Rapamycin促進(jìn)自噬后抑制了 MORN4敲減導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡,表明MORN4敲減導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡與自噬抑制有關(guān);而B(niǎo)af A1阻斷自噬流并沒(méi)有進(jìn)一步影響心肌細(xì)胞凋亡的變化,表明MORN4敲減通過(guò)阻斷自噬流進(jìn)而抑制自噬促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。1.6 SPC通過(guò)MORN4抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡我們接下來(lái)利用MORN4的干擾RNA檢測(cè)SPC是否通過(guò)MORN4保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示干擾MORN4后逆轉(zhuǎn)了 SPC降低的PARP和caspase3的切割。因此,SPC通過(guò)MORN4保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡。1.7SPC通過(guò)MORN4與mitofusion2(MFN2)的相互作用促進(jìn)自噬Western blot結(jié)果表明缺血時(shí)MFN2的表達(dá)升高,為了明確MORN4是否通過(guò)MFN2調(diào)節(jié)自噬,首先檢測(cè)了 MORN4對(duì)MFN2的影響,結(jié)果表明干擾MORN4抑制,而過(guò)表達(dá)MORN4促進(jìn)MFN2的表達(dá)。Co-IP結(jié)果顯示MORN4可以與MFN2直接結(jié)合。Western blot結(jié)果表明,SPC可以逆轉(zhuǎn)MORN4敲減導(dǎo)致的MFN2的降低。因此,SPC可能通過(guò)MORN4與mitofusion2(MFN2)的相互作用促進(jìn)自噬。1.8 SPC通過(guò)JNK促進(jìn)MORN4表達(dá),而MORN4負(fù)反饋調(diào)節(jié)JNK。SPC可通過(guò)JNK調(diào)節(jié)自噬,我們探究了 JNK與MORN4之間的關(guān)系。免疫熒光結(jié)果顯示JNK磷酸化的抑制劑SP600125降低MORN4的表達(dá),而western結(jié)果表明干擾MORN4后磷酸化的JNK升高。因此SPC通過(guò)磷酸化JNK促進(jìn)MORN4的表達(dá),而MORN4對(duì)JNK有負(fù)反饋調(diào)節(jié)。2.NR4A2通過(guò)促進(jìn)自噬抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡2.1 NR4A2在缺血心肌細(xì)胞中的表達(dá)升高我們利用QPCR,western blot及免疫熒光檢測(cè)了 NR4A2在缺血心肌細(xì)胞中的變化,發(fā)現(xiàn)NR4A2在去除血清的H9c2細(xì)胞中,mRNA水平和蛋白水平都有明顯升高。2.2 NR4A2抑制缺血H9c2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞的凋亡為了探究NR4A2在缺血引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用,我們使用了 NR4A2干擾RNA和NR4A2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,并利用QPCR及western blot對(duì)效果進(jìn)行了驗(yàn)證。NR4A2敲減后,PARP和caspase3的切割明顯高于對(duì)照組,TUNEL染色發(fā)現(xiàn)NR4A2敲減后,凋亡細(xì)胞明顯增多;而過(guò)表達(dá)NR4A2能夠減少缺血心肌細(xì)胞PARP和caspase3的切割。因此,NR4A2抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡。2.3干擾NR4A2抑制心肌細(xì)胞的自噬流為了明確NR4A2是否影響心肌細(xì)胞的自噬,我們利用NR4A2的siRNA抑制NR4A2的表達(dá),western blot結(jié)果顯示NR4A2敲減能上調(diào)LC3-Ⅱ水平;轉(zhuǎn)入pEGFP-LC3之后,免疫熒光結(jié)果表明NR4A2敲減使LC3點(diǎn)狀聚集增加,NR4A2過(guò)表達(dá)則使LC3-Ⅱ明顯降低。我們進(jìn)一步利用自噬流的阻斷劑BafA1和NH4Cl以及自噬起始的抑制劑3MA驗(yàn)證NR4A2的作用,western blot結(jié)果表明NR4A2敲減抑制了缺血心肌細(xì)胞的自噬流。2.4干擾NR4A2通過(guò)抑制自噬流促進(jìn)缺血H9c2細(xì)胞的凋亡為了明確NR4A2調(diào)節(jié)的自噬與凋亡是否相關(guān),我們使用了自噬的抑制劑Baf A1,western blot顯示PARP和caspase3切割沒(méi)有進(jìn)一步升高;而自噬促進(jìn)劑Rapamycin加入后心肌細(xì)胞的PARP和caspase3切割明顯被抑制。因此,干擾NR4A2通過(guò)阻斷自噬流促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。2.5 NR4A2通過(guò)p53/Bax抑制H9c2心肌細(xì)胞凋亡。為了檢測(cè)NR4A2在H9c2心肌細(xì)胞中是否通過(guò)p53/Bax抑制心肌細(xì)胞凋亡,我們將NR4A2進(jìn)行干擾或過(guò)表達(dá),western blot結(jié)果表明NR4A2敲減后p53和Bax的表達(dá)都升高,而NR4A2過(guò)表達(dá)后,p53和Bax的表達(dá)都降低。co-IP結(jié)果顯示p53能與NR4A2相結(jié)合,表明NR4A2通過(guò)p53/Bax抑制心肌細(xì)胞凋亡。免疫熒光結(jié)果表明NR4A2抑制了 p53在細(xì)胞核的定位,由于p53在細(xì)胞核中促進(jìn)細(xì)胞自噬,表明NR4A2可能也通過(guò)p53調(diào)節(jié)自噬。2.6 MiR-212-3p 是 NR4A2/p53/Bax 的上游因子QPCR結(jié)果表明miR-212-3p在缺血時(shí)表達(dá)降低,而且軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)MiR-212-3p能夠靶向NR4A2,因此MiR-212-3p可能是靶向NR4A2的上游因子。QPCR 和 western blot 結(jié)果表明,MiR-212-3p 的 inhibitor 上調(diào) NR4A2 RNA 和蛋白水平的表達(dá),而mimics則抑制其表達(dá),表明miR-212-3p能夠調(diào)節(jié)NR4A2;雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-212-3p直接靶向NR4A2。而且,MiR-212-3p的inhibitor抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡,抑制p53和Bax的水平,與NR4A2的作用一致。因此,miR-212-3p是NR4A2/p53/Bax的上游調(diào)節(jié)子。由上述結(jié)果我們得出結(jié)論:SPC能通過(guò)MORN4與MFN2相互結(jié)合促進(jìn)自噬流抑制心肌細(xì)胞的凋亡,MORN4在缺血環(huán)境下應(yīng)激性升高,對(duì)抗缺血引起的凋亡;NR4A2受到miR-212-3p調(diào)控,通過(guò)p53/Bax抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：1613492