本文選題：apelin-13　切入點：自噬　出處：《南華大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)性心腦血管疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康和生命的重大疾病,其發(fā)生機制涉及炎癥、損傷應(yīng)答和脂質(zhì)代謝異常等眾多因素。其中單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞,吞噬脂蛋白源性的過量膽固醇,進(jìn)而在血管壁上形成泡沫細(xì)胞,是動脈粥樣硬化發(fā)病過程中的一個關(guān)鍵事件。自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體系統(tǒng)降解細(xì)胞聚集蛋白、受損細(xì)胞器和各種大分子物質(zhì)的過程。近年研究表明自噬與As緊密相關(guān),一種自噬特殊形式—脂噬(lipophagy),能將巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯(cholesterol ester,CE)運輸至溶酶體,被溶酶體脂酶降解后通過細(xì)胞膜蛋白三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)運送至高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL),促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。因此自噬是促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出和防治動脈粥樣硬性心血管疾病的一個潛在靶標(biāo)。Apelin是脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪因子,具有生物活性的肽類激素,在體內(nèi)組織分布廣泛,尤其在心血管組織高表達(dá)。它與其受體構(gòu)成Apelin/APJ系統(tǒng),主要參與血管氧化應(yīng)激反應(yīng)過程,對心血管系統(tǒng)有重要的調(diào)節(jié)作用。體內(nèi)常見的有apelin-36、17、13、和12等幾種形式,其中生物活性最強是apelin-13。在心血管疾病患者血漿中apelin水平比正常人顯著下降,并與動脈粥樣斑塊的發(fā)展及穩(wěn)定密切相關(guān)。提示apelin具有抗動脈粥樣硬化作用,但具體機制尚未明了。自噬的過程及其機制復(fù)雜,受許多信號通路調(diào)控,其中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3Ks)是自噬途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。其中Class I PI3K和Class III PI3K信號途徑在不同時期調(diào)控自噬作用。新近研究發(fā)現(xiàn)apelin通過PI3Ks信號通路誘導(dǎo)自噬參與細(xì)胞的保護(hù)作用,提示apelin抗As作用與自噬密切相關(guān)。本研究從自噬入手,并通過不同方法干預(yù)PI3Ks信號途徑,觀察其對apelin-13作用的影響,以探討apelin-13與自噬之間的作用關(guān)系及信號傳導(dǎo)機制,從而為揭示apelin-13在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的可能作用和機制提供新的研究思路。第一部分Apelin-13通過誘導(dǎo)自噬對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出的影響目的:觀察apelin-13對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出和自噬的作用,同時觀察apelin-13調(diào)控自噬變化對細(xì)胞膽固醇流出的影響。方法:培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞,用佛波酯(phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞貼壁分化為巨噬細(xì)胞。THP-1源性巨噬細(xì)胞與ox-LDL共孵育分化、形成泡沫細(xì)胞,得到巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。用apelin-13處理泡沫細(xì)胞,觀察apelin-13對膽固醇流出、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響的濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)。分別用液體閃爍計數(shù)法、油紅O染色及高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出、脂滴及膽固醇水平。構(gòu)建熒光真核表達(dá)載體pc DNA3.1-GFP-LC3,轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞中自噬體形成情況,采用Western blotting免疫印跡分別檢測細(xì)胞中LC3和p62蛋白質(zhì)的表達(dá)。用apelin抑制劑百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)、自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin)、自噬抑制劑長春花堿(vinblastine)對apelin-13作用下的細(xì)胞共處理,檢測細(xì)胞內(nèi)自噬活性,并觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和膽固醇流出的影響。結(jié)果:不同濃度的apelin-13(0,1,10,100 n M apelin-13)處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24h后,液體閃爍計數(shù)法檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出增多。高效液相色譜法檢測顯示細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯減少,同時油紅O也證實細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少,并且以上效應(yīng)呈濃度依賴性。Western blotting檢測自噬蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,apelin-13可呈濃度依賴性上調(diào)細(xì)胞LC3蛋白的表達(dá),而下調(diào)p62表達(dá)。以100 n M apelin-13不同時間(0,6,12,24小時)分別處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積明顯降低,細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量顯著減少,細(xì)胞內(nèi)流出的膽固醇明顯增加,且隨時間的延長,效應(yīng)越明顯,提示apelin-13的作用呈時間依賴性。Western blotting免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中LC3蛋白表達(dá)呈時間依賴性的上調(diào),p62表達(dá)呈時間依賴性下調(diào)。Apelin抑制劑PTX預(yù)處理細(xì)胞后,apelin-13對上述的效應(yīng)隨即取消。自噬激動劑rapamycin預(yù)處理細(xì)胞后,增強apelin-13對細(xì)胞的自噬,增加了自噬體數(shù)量,促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出,減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。而自噬抑制劑vinblastine預(yù)處理細(xì)胞后,減弱apelin-13對細(xì)胞自噬的影響,減少了自噬體數(shù)量,抑制了細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。結(jié)論:(1)apelin-13呈濃度依賴性和時間依賴性的方式促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出,減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積;(2)apelin-13以時間依賴性和濃度依賴性的方式上調(diào)LC3、下調(diào)p62表達(dá),促使自噬體形成。(3)apelin-13通過自噬,增加巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出,減少脂質(zhì)蓄積,抑制泡沫細(xì)胞的形成。第二部分Apelin-13通過誘導(dǎo)自噬對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出的分子機制目的:探討apelin-13誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞自噬和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的分子機制。方法:培養(yǎng)THP-1細(xì)胞株,以佛波酯(phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)和ox-LDL誘導(dǎo)分化并形成泡沫細(xì)胞,復(fù)制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。采用apelin-13和(或)Class I PI3K及Class III PI3K信號途徑中關(guān)鍵分子的相關(guān)抑制劑和RNA干擾等共同處理細(xì)胞,以液體閃爍計數(shù)法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出率,Western blotting分別檢測細(xì)胞中自噬蛋白LC3和p62的表達(dá),并檢測Class I PI3K和Class III PI3K信號途徑各關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。結(jié)果:不同濃度的apelin-13(0,1,10,100 n M apelin-13)處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24h后,Western blotting結(jié)果顯示,apelin-13濃度依賴性下調(diào)Class I PI3K蛋白的表達(dá)、下調(diào)Akt和m TOR磷酸化和上調(diào)PTEN和ULK1蛋白表達(dá);采用PTEN特異抑制劑SF1670處理細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,SF1670單獨處理組LC3-Ⅱ/LC3-I比值下降,上調(diào)了p62的表達(dá);與apelin-13組相比,SF1670預(yù)處理細(xì)胞再加入apelin-13相比,LC3-Ⅱ/LC3-I比值下降,p62表達(dá)上調(diào)。液體閃爍計數(shù)法檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,SF1670可減少細(xì)胞膽固醇的流出;與單獨用apelin-13處理組的細(xì)胞比較,apelin-13與SF1670共處理細(xì)胞,可以減少細(xì)胞膽固醇的流出;ULK1的si RNA處理細(xì)胞后,結(jié)果顯示,與Control-si RNA組相比,Control-si RNA加apelin-13共同處理組LC3-Ⅱ/LC3-I比值上調(diào),p62蛋白表達(dá)下調(diào);與Control-si RNA加apelin-13共同處理組相比,而ULK1-si RNA組加apelin-13組,LC3-Ⅱ/LC3-I比值顯著下降,p62表達(dá)顯著上調(diào),液體閃爍計數(shù)法檢測細(xì)胞膽固醇的流出率。結(jié)果顯示,與Control-si RNA組相比,Control-si RNA加apelin-13共同處理增加細(xì)胞膽固醇的流出。與Control-si RNA加apelin-13共同處理組相比,而ULK1-si RNA組加apelin-13組明顯抑制細(xì)胞膽固醇的流出。同時結(jié)果顯示apelin-13呈劑量依賴性上調(diào)了Class III PI3K和Beclin-1表達(dá)。Class III PI3K特異抑制劑3-MA處理細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,單獨3-MA處理下調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-I比值,上調(diào)了p62的表達(dá),與apelin-13組相比,與3-MA預(yù)處理細(xì)胞再加入apelin-13相比,LC3-Ⅱ/LC3-I比值下調(diào),p62上調(diào),液體閃爍計數(shù)法檢測細(xì)胞膽固醇的流出率。結(jié)果顯示,與對照組相比,3-MA可減少細(xì)胞膽固醇的流出。與單獨用apelin-13處理組的細(xì)胞比較,apelin-13與3-MA共處理細(xì)胞,可以減少細(xì)胞膽固醇的流出。Beclin-1si RNA處理細(xì)胞后,結(jié)果顯示,與Control-si RNA組相比,Control-si RNA加apelin-13共同處理組LC3-Ⅱ/LC3-I比值上調(diào),p62蛋白表達(dá)下調(diào);與Control-si RNA加apelin-13共同處理組相比,而Beclin-1-si RNA組加apelin-13組,LC3-Ⅱ/LC3-I比值顯著下降,p62表達(dá)顯著上調(diào),液體閃爍計數(shù)法檢測細(xì)胞膽固醇的流出率。結(jié)果顯示,與Control-si RNA組相比,Control-si RNA加apelin-13共同處理增加細(xì)胞膽固醇的流出。與Control-si RNA加apelin-13共同處理組相比,而Beclin-1-si RNA組加apelin-13組明顯抑制細(xì)胞膽固醇的流出。結(jié)論:(1)apelin-13抑制Class I PI3K信號途徑關(guān)鍵蛋白,促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出,減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積;(2)apelin-13激活Class III PI3K信號途徑關(guān)鍵蛋白表達(dá),促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出,減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積。第三部分Apelin-13調(diào)控自噬對apo E~(-/-)小鼠膽固醇逆向轉(zhuǎn)運、動脈壁脂質(zhì)蓄積和動脈粥樣硬化病變的影響目的:以apo E~(-/-)小鼠為實驗對象進(jìn)行體內(nèi)研究,觀察apelin-13對apo E~(-/-)小鼠體內(nèi)RCT、血脂水平、主動脈壁內(nèi)脂質(zhì)蓄積、As病變及自噬水平的影響。初步探討其作用機制。方法:6周齡雄性apo E~(-/-)小鼠隨機分成4組(每組15只),以高脂/高膽固醇(high-fat/high-cholesterol diet,HF/HC,79.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料、0.5%膽酸鈉、4%奶粉、2%膽固醇、10%豬油和4%蛋黃粉配制)飼料飼養(yǎng)。其中,對照組(Con group)僅飼以高脂/高膽固醇飲食,隔天腹腔注射與實驗組同等劑量的生理鹽水;apelin-13(APLN group)組除飼以高脂/高膽固醇飲食外,隔天腹腔注射apelin-13(劑量1μg/kg);PTX+apelin-13組(PTX+APLN group)除飼以高脂/高膽固醇飲食外,隔天腹腔注射PTX(劑量4 mg/kg)4h后再注射apelin-13(劑量1μg/kg);PTX(PTX group)組除飼以高脂/高膽固醇飲食外,隔天腹腔注射PTX(劑量劑量4 mg/kg)。8周后處死動物,體視顯微鏡下觀察血管As形成情況;HE染色觀察主動脈竇處斑塊形成情況;油紅O染色觀察主動脈和主動脈竇As病變處脂質(zhì)蓄積情況;Masson氏染色法檢測斑塊膠原纖維面積;液體閃爍計數(shù)儀測定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(mouse peritoneal macrophage,MPM)來源的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transportation,RCT)效率;;全自動生化分析儀檢測甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平;高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法檢測apo E~(-/-)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)水平;Western blot法檢測小鼠主動脈組織和腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果:(1)主動脈體視顯微鏡觀察結(jié)果顯示,apelin-13組小鼠主動脈內(nèi)斑塊較對照組顯著減少,而PTX+apelin-13組小鼠主動脈內(nèi)斑塊較apelin-13組顯著增加。(2)油紅O染色顯示,與對照組相比,apelin-13組小鼠主動脈竇斑塊脂質(zhì)蓄積明顯減少;與apelin-13組相比,PTX+apelin-13組小鼠的主動脈竇處的病變脂質(zhì)蓄積明顯增加。(3)Masson三色染色結(jié)果顯示,apelin-13組小鼠主動脈竇病變膠原纖維含量較對照組顯著減少;與apelin-13對照組相比,PTX+apelin-13組小鼠的主動脈竇處的病變膠原纖維含量顯著增加。(4)液體閃爍計數(shù)儀測定各組樣本的3H-膽固醇放射活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對于對照組,apelin-13組巨噬細(xì)胞來源的膽固醇在血清、肝臟、膽囊及糞便3H-膽固醇含量明顯增多;與apelin-13組相比,PTX+apelin-13組在血清、肝臟膽囊及糞便中3H-膽固醇含量明顯減少。(5)全自動生化分析儀檢測顯示,四組動物的體重、TG及TC均無顯著差異。apelin-13組動物的血漿LDL-C水平較高脂對照組明顯下降,HDL-C水平則升高;PTX+apelin-13組比apelin-13組動物的血漿LDL-C水平明顯升高,HDL-C水平則下降(6)HPLC結(jié)果顯示,與對照組相比,apelin-13組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)水平明顯降低;與apelin-13組相比,PTX+apelin-13組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)水平顯著升高,(7)Western blot檢測自噬蛋白結(jié)果顯示,與對照組相比,apelin-13組小鼠主動脈LC3蛋白表達(dá)明顯升高、p62蛋白表達(dá)明顯降低;與apelin-13組相比,PTX+apelin-13組小鼠主動脈LC3蛋白表達(dá)明顯降低、p62蛋白表達(dá)明顯升高,(8)Western blot檢測I型PI3K信號通路關(guān)鍵蛋白結(jié)果顯示,與對照組相比,apelin-13組小鼠主動脈PTEN蛋白表達(dá)明顯升高、Class I PI3K蛋白表達(dá)明顯降低;與apelin-13組相比,PTX+apelin-13組小鼠主動脈PTEN蛋白表達(dá)明顯降低、Class I PI3K蛋白表達(dá)明顯升高。并且apelin-13組小鼠主動脈Akt、m TOR磷酸化相對于對照組顯著降低;PTX+apelin-13組小鼠主動脈Akt、m TOR磷酸化相對于apelin-13組顯著升高。(9)Western blot法檢測Class III PI3K和Beclin-1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,與對照組相比,apelin-13組小鼠主動脈Class III PI3K和Beclin-1蛋白表達(dá)明顯升高;與apelin-13組相比,PTX+apelin-13組小鼠主動脈Class III PI3K和Beclin-1蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論:(1)Apelin-13抑制apo E~(-/-)小鼠As病變的發(fā)生發(fā)展;(2)apelin-13抑制apo E~(-/-)小鼠As斑塊內(nèi)的脂質(zhì)蓄積、改善血漿脂質(zhì)成分和促進(jìn)體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運;(3)apelin-13可能通過自噬促進(jìn)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出延緩apo E~(-/-)小鼠血管壁As的形成。(4)apelin-13抗As的作用與PTEN/Class I PI3K/Akt和Class III PI3K/Beclin-1信號途徑相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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1 伍靜;趙勇;師長宏;張海;;自噬的形態(tài)特征及分子調(diào)控[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年20期

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本文編號：1589366