本文選題：微小RNA-208a　切入點(diǎn)：nemo樣激酶　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)每年導(dǎo)致全球范圍內(nèi)約1,700萬(wàn)人死亡,預(yù)計(jì)到2030年會(huì)增加到23,600萬(wàn),已經(jīng)成為危害人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手。其中缺血性心臟病(ischemic heart disease)在2010年導(dǎo)致全球約700萬(wàn)患者死亡,比1990年增加了35%。心肌細(xì)胞凋亡以及心臟成纖維細(xì)胞增殖分化、心肌纖維化,導(dǎo)致了以心室重構(gòu)為病理基礎(chǔ)的心力衰竭是缺血性心臟病患者的主要死亡原因�；谛募〖�(xì)胞凋亡以及心肌纖維化導(dǎo)致的一系列嚴(yán)重后果,探討其發(fā)生發(fā)展機(jī)制、研究和尋找防治的新靶點(diǎn)和有效藥物是目前亟待解決的醫(yī)學(xué)難題,日益受到國(guó)內(nèi)外心血管專(zhuān)家的重視。微小RNA(microRNAs, miRNAs)是在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、約22個(gè)核苷酸構(gòu)成的、內(nèi)源性非編碼RNA分子,通過(guò)抑制靶分子mRNA(messenger RNA)的翻譯或促進(jìn)其降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)了其表達(dá),參與了機(jī)體多種生理和病理的過(guò)程。miR-208家族由miR-208a, miR-208b和miR-499組成,分別由α-心肌肌球蛋白重鏈基因(a-cardiac muscle myosin heavy chain gene, α-MHC/Myh6),β-心肌肌球蛋白重鏈基因(B-cardiac muscle myosin heavy chain gene, β-MHC/Myh7)和Myh7b基因編碼,在調(diào)節(jié)肌球蛋白含量、肌纖維密度和肌肉性能方面起著至關(guān)重要的作用。研究表明,miR-208a在心肌組織中特異性表達(dá),miR-208b和miR-499可在心肌和骨骼肌中表達(dá)。在動(dòng)物中研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-208a能夠誘導(dǎo)心室肥厚,纖維化和心功能不全,而下調(diào)miR-208a的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)胸主動(dòng)脈結(jié)扎,高鹽飲食和心肌缺血等應(yīng)激誘導(dǎo)的心室肥厚,心肌纖維化以及保護(hù)心功能。臨床研究發(fā)現(xiàn),血清或血漿中異常升高的niR-208a是早期診斷急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)的生物學(xué)標(biāo)志物之一。但是,迄今為止,miR-208a對(duì)應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞凋亡的影響以及miR-208a誘導(dǎo)心肌纖維化的機(jī)制尚不明確?Nemo-like kinase (NLK)是進(jìn)化上內(nèi)源性保守ERK-2/MAPK樣激酶,廣泛分布于機(jī)體各組織器官。NLK可通過(guò)磷酸化或泛素化等機(jī)制調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路的關(guān)鍵分子,在細(xì)胞增殖、遷徙和凋亡等方面具有重要功能。通過(guò)查詢miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),NLK的3’-非編碼區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)在序列上和1niR-208a互補(bǔ)結(jié)合,是miR-208a潛在的靶分子之一。但是,miR-208a能否通過(guò)靶向抑制NLK調(diào)控心肌凋亡以及心臟成纖維細(xì)胞值分化目前尚不清楚。因此,本課題探討以下內(nèi)容：首先,在體建立大鼠AMI后心肌細(xì)胞凋亡和纖維化模型,采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白印記技術(shù)(western blot)觀察內(nèi)源性miR-208a和NLK在AMI后的表達(dá)變化。其次,在體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞中,研究miR-208a在血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的功能。采用熒光素酶報(bào)告基因(luciferase reporter assay)實(shí)驗(yàn)確定NLK是否為miR-208a調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的靶蛋白之一,并進(jìn)一步探討NLK在心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用和機(jī)制。最后,在原代心臟成纖維細(xì)胞,研究miR-208a和NLK調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞增殖分化的功能和機(jī)制。研究的結(jié)果如下：1.miR-208a在AMI后表達(dá)增加,NLK表達(dá)減少大鼠AMI后出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化。HE染色見(jiàn)模型組心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),梗死區(qū)周?chē)募〖?xì)胞肥大；心臟成纖維細(xì)胞增生,假手術(shù)組心肌細(xì)胞基本正常。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)模型組非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡比例明顯增多。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),模型組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少,促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達(dá)增加。Masson染色見(jiàn)模型組非梗死區(qū)心肌間質(zhì)膠原容積增加,Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),模型組心肌miR-208a表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization, ISH)發(fā)現(xiàn)模型組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)miR-208a表達(dá)增加,其中以梗死區(qū)周?chē)募〖?xì)胞明顯。模型組NLK mRNA及蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組明顯減少。免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)染色提示模型組非梗死區(qū)心肌細(xì)胞漿內(nèi)NLK表達(dá)較明顯降低。體內(nèi)研究表明：異常表達(dá)的miR-208a和NLK可能參與了心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化的進(jìn)程。2. Ang Ⅱ上調(diào)H9C2細(xì)胞miR-208a表達(dá),并誘導(dǎo)其凋亡在體外采用不同濃度的Ang Ⅱ(0,50,100和200 nM)刺激H9C2心肌細(xì)胞24h,qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-208a表達(dá)呈濃度依賴性上調(diào),并在Ang Ⅱ(100 nM)干預(yù)24h時(shí)達(dá)到高峰。采用Ang Ⅱ(100 nM)干預(yù)H9C2細(xì)胞24h,流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ組細(xì)胞凋亡的比例較空白對(duì)照組增加。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ降低了抗凋亡蛋白Bcl-2水平,升高了促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達(dá),提示上調(diào)的miR-208a可能與H9C2細(xì)胞凋亡相關(guān)。3.上調(diào)miR-208a促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡在體外分別進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-208a mimics, inhibitors和各自對(duì)照物8h后,再以Ang Ⅱ (100 nM);刺激H9C2細(xì)胞24h,采用FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-208a mimics(200nM)組細(xì)胞調(diào)亡的比例較對(duì)照組明顯增加,miR-208a inhibitors (200nM)組細(xì)胞凋亡比例明顯減少。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-208a mimics組NLK蛋白和抗調(diào)亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減少,而miR-208a inhibitors組NLK蛋白和抗調(diào)亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增加。以上結(jié)果提示,miR-208a可能通過(guò)抑制NLK和Bcl-2蛋白表達(dá)促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡。4.NLK是miR-208a促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的有效靶分子之一為了驗(yàn)證NLK是否是1miR-208a的靶蛋白,采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-208a mimics, inhibitors和各自對(duì)照物8h。Western blot發(fā)現(xiàn)miR-208a mimics (200nM)組NLK蛋白表達(dá)下調(diào),而1miR-208a inhibitors (200nM)組NLK蛋白表達(dá)上調(diào)。熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)染miR-208a mimics (200nM)和NLK-WT能夠抑制NLK的熒光活性,而共轉(zhuǎn)染miR-208a inhibitors (200nM)和NLK-WT能夠上調(diào)NLK的熒光活性。5.NLK調(diào)控AngⅡ誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡為了明確NLK調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制和功能,在體外分別進(jìn)行siRNA-NLK和pcDNA3.1(+)-NLK細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染siRNA-NLK 8h,再以AngⅡ(100nM)干預(yù)H9C2細(xì)胞24h。Western blot發(fā)現(xiàn)siRNA-NLK組的NLK和Bcl-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)；FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siRNA-NLK組細(xì)胞凋亡的比例增加,提示下調(diào)NLK促進(jìn)了AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NLK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒8h,再以Ang Ⅱ(100 nM)干預(yù)H9C2細(xì)胞24h。Western blot發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1(+)-NLK組的NLK和Bcl-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)；FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn),pcDNA3.1(+)-NLK組細(xì)胞凋亡比例減少,提示上調(diào)NLK抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。6.上調(diào)miR-208a促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞的增殖和分化在體外培養(yǎng)的原代大鼠心臟成纖維細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),不同濃度的Ang Ⅱ(0,50,100和200 nnM)刺激細(xì)胞24h,miR-208a表達(dá)呈濃度依賴性上調(diào)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)a-SMA蛋白水平也呈濃度依賴性增加。在體外分別轉(zhuǎn)染miR-208a mimics和mimics control 8h,再以AngⅡ(100nM)干預(yù)心臟成纖維細(xì)胞24h。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-208a mimics (200nM)組a-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高,FCM分析發(fā)現(xiàn)miR-208a mimics (200nM)組心臟成纖維細(xì)胞的增殖比例也升高。在體外分別轉(zhuǎn)染-208a inhibitors和inhibitors control 8h,再以Ang Ⅱ(100 nM)干預(yù)心臟成纖維細(xì)胞24h。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-208a inhibitor (200nM)組a-SMA和Ⅰ型膠原蛋白水平較對(duì)照組下降,FCM分析發(fā)現(xiàn)miR-208a inhibitors(200nM)組心臟成纖維細(xì)胞增殖明顯減少。該結(jié)果提示：miR-208a促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖分化,這可能是miR-208a促進(jìn)心肌纖維化的重要原因之一。7.下調(diào)NLK抑制心臟成纖維細(xì)胞的增殖和分化在心臟成纖維細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染siRNA-NLK和siRNA control 8h, Ang Ⅱ (100nM)干預(yù)24h。qRT-PCR和western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ上調(diào)NLK mRNA和蛋白表達(dá),siRNA-NLK組NLK mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siRNA-NLK組a-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)減少,FCM分析發(fā)現(xiàn),siRNA-NLK組心臟成纖維細(xì)胞增殖較對(duì)照組明顯降低,抑制NLK減少了心臟成纖維細(xì)胞的增殖分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：1589048