發(fā)布時間：2018-03-09 15:05

  本文選題：微小RNA-208a　切入點：nemo樣激酶　出處：《安徽醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)每年導致全球范圍內(nèi)約1,700萬人死亡,預計到2030年會增加到23,600萬,已經(jīng)成為危害人類健康的頭號殺手。其中缺血性心臟病(ischemic heart disease)在2010年導致全球約700萬患者死亡,比1990年增加了35%。心肌細胞凋亡以及心臟成纖維細胞增殖分化、心肌纖維化,導致了以心室重構(gòu)為病理基礎的心力衰竭是缺血性心臟病患者的主要死亡原因。基于心肌細胞凋亡以及心肌纖維化導致的一系列嚴重后果,探討其發(fā)生發(fā)展機制、研究和尋找防治的新靶點和有效藥物是目前亟待解決的醫(yī)學難題,日益受到國內(nèi)外心血管專家的重視。微小RNA(microRNAs, miRNAs)是在進化過程中高度保守的、約22個核苷酸構(gòu)成的、內(nèi)源性非編碼RNA分子,通過抑制靶分子mRNA(messenger RNA)的翻譯或促進其降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)了其表達,參與了機體多種生理和病理的過程。miR-208家族由miR-208a, miR-208b和miR-499組成,分別由α-心肌肌球蛋白重鏈基因(a-cardiac muscle myosin heavy chain gene, α-MHC/Myh6),β-心肌肌球蛋白重鏈基因(B-cardiac muscle myosin heavy chain gene, β-MHC/Myh7)和Myh7b基因編碼,在調(diào)節(jié)肌球蛋白含量、肌纖維密度和肌肉性能方面起著至關重要的作用。研究表明,miR-208a在心肌組織中特異性表達,miR-208b和miR-499可在心肌和骨骼肌中表達。在動物中研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-208a能夠誘導心室肥厚,纖維化和心功能不全,而下調(diào)miR-208a的表達可以逆轉(zhuǎn)胸主動脈結(jié)扎,高鹽飲食和心肌缺血等應激誘導的心室肥厚,心肌纖維化以及保護心功能。臨床研究發(fā)現(xiàn),血清或血漿中異常升高的niR-208a是早期診斷急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)的生物學標志物之一。但是,迄今為止,miR-208a對應激條件下心肌細胞凋亡的影響以及miR-208a誘導心肌纖維化的機制尚不明確?Nemo-like kinase (NLK)是進化上內(nèi)源性保守ERK-2/MAPK樣激酶,廣泛分布于機體各組織器官。NLK可通過磷酸化或泛素化等機制調(diào)節(jié)多種信號通路的關鍵分子,在細胞增殖、遷徙和凋亡等方面具有重要功能。通過查詢miRbase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),NLK的3’-非編碼區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)在序列上和1niR-208a互補結(jié)合,是miR-208a潛在的靶分子之一。但是,miR-208a能否通過靶向抑制NLK調(diào)控心肌凋亡以及心臟成纖維細胞值分化目前尚不清楚。因此,本課題探討以下內(nèi)容：首先,在體建立大鼠AMI后心肌細胞凋亡和纖維化模型,采用實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白印記技術(shù)(western blot)觀察內(nèi)源性miR-208a和NLK在AMI后的表達變化。其次,在體外培養(yǎng)的H9C2心肌細胞中,研究miR-208a在血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)誘導的心肌細胞凋亡過程中的功能。采用熒光素酶報告基因(luciferase reporter assay)實驗確定NLK是否為miR-208a調(diào)節(jié)細胞凋亡的靶蛋白之一,并進一步探討NLK在心肌細胞凋亡過程中的作用和機制。最后,在原代心臟成纖維細胞,研究miR-208a和NLK調(diào)控心臟成纖維細胞增殖分化的功能和機制。研究的結(jié)果如下：1.miR-208a在AMI后表達增加,NLK表達減少大鼠AMI后出現(xiàn)明顯的心肌細胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化。HE染色見模型組心肌細胞出現(xiàn)明顯的壞死及炎性細胞浸潤,梗死區(qū)周圍心肌細胞肥大；心臟成纖維細胞增生,假手術(shù)組心肌細胞基本正常。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)模型組非梗死區(qū)心肌細胞凋亡比例明顯增多。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),模型組抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少,促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達增加。Masson染色見模型組非梗死區(qū)心肌間質(zhì)膠原容積增加,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)模型組a-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白表達較假手術(shù)組明顯增加。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),模型組心肌miR-208a表達較假手術(shù)組明顯升高。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization, ISH)發(fā)現(xiàn)模型組心肌細胞胞漿內(nèi)miR-208a表達增加,其中以梗死區(qū)周圍心肌細胞明顯。模型組NLK mRNA及蛋白表達均較假手術(shù)組明顯減少。免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)染色提示模型組非梗死區(qū)心肌細胞漿內(nèi)NLK表達較明顯降低。體內(nèi)研究表明：異常表達的miR-208a和NLK可能參與了心肌細胞凋亡和心肌纖維化的進程。2. Ang Ⅱ上調(diào)H9C2細胞miR-208a表達,并誘導其凋亡在體外采用不同濃度的Ang Ⅱ(0,50,100和200 nM)刺激H9C2心肌細胞24h,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-208a表達呈濃度依賴性上調(diào),并在Ang Ⅱ(100 nM)干預24h時達到高峰。采用Ang Ⅱ(100 nM)干預H9C2細胞24h,流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM)發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ組細胞凋亡的比例較空白對照組增加。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ降低了抗凋亡蛋白Bcl-2水平,升高了促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達,提示上調(diào)的miR-208a可能與H9C2細胞凋亡相關。3.上調(diào)miR-208a促進Ang Ⅱ誘導的H9C2細胞凋亡在體外分別進行細胞轉(zhuǎn)染miR-208a mimics, inhibitors和各自對照物8h后,再以Ang Ⅱ (100 nM);刺激H9C2細胞24h,采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)miR-208a mimics(200nM)組細胞調(diào)亡的比例較對照組明顯增加,miR-208a inhibitors (200nM)組細胞凋亡比例明顯減少。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),miR-208a mimics組NLK蛋白和抗調(diào)亡蛋白Bcl-2表達明顯減少,而miR-208a inhibitors組NLK蛋白和抗調(diào)亡蛋白Bcl-2表達顯著增加。以上結(jié)果提示,miR-208a可能通過抑制NLK和Bcl-2蛋白表達促進Ang Ⅱ誘導的H9C2細胞凋亡。4.NLK是miR-208a促進心肌細胞凋亡的有效靶分子之一為了驗證NLK是否是1miR-208a的靶蛋白,采用細胞轉(zhuǎn)染miR-208a mimics, inhibitors和各自對照物8h。Western blot發(fā)現(xiàn)miR-208a mimics (200nM)組NLK蛋白表達下調(diào),而1miR-208a inhibitors (200nM)組NLK蛋白表達上調(diào)。熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)染miR-208a mimics (200nM)和NLK-WT能夠抑制NLK的熒光活性,而共轉(zhuǎn)染miR-208a inhibitors (200nM)和NLK-WT能夠上調(diào)NLK的熒光活性。5.NLK調(diào)控AngⅡ誘導的H9C2細胞凋亡為了明確NLK調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡的機制和功能,在體外分別進行siRNA-NLK和pcDNA3.1(+)-NLK細胞轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染siRNA-NLK 8h,再以AngⅡ(100nM)干預H9C2細胞24h。Western blot發(fā)現(xiàn)siRNA-NLK組的NLK和Bcl-2蛋白表達較對照組明顯下調(diào)；FCM檢測發(fā)現(xiàn)siRNA-NLK組細胞凋亡的比例增加,提示下調(diào)NLK促進了AngⅡ誘導的細胞凋亡。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NLK過表達質(zhì)粒8h,再以Ang Ⅱ(100 nM)干預H9C2細胞24h。Western blot發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1(+)-NLK組的NLK和Bcl-2蛋白表達較對照組明顯上調(diào)；FCM檢測發(fā)現(xiàn),pcDNA3.1(+)-NLK組細胞凋亡比例減少,提示上調(diào)NLK抑制了AngⅡ誘導的細胞凋亡。6.上調(diào)miR-208a促進AngⅡ誘導的心臟成纖維細胞的增殖和分化在體外培養(yǎng)的原代大鼠心臟成纖維細胞研究發(fā)現(xiàn),不同濃度的Ang Ⅱ(0,50,100和200 nnM)刺激細胞24h,miR-208a表達呈濃度依賴性上調(diào)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)a-SMA蛋白水平也呈濃度依賴性增加。在體外分別轉(zhuǎn)染miR-208a mimics和mimics control 8h,再以AngⅡ(100nM)干預心臟成纖維細胞24h。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)miR-208a mimics (200nM)組a-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達較對照組明顯升高,FCM分析發(fā)現(xiàn)miR-208a mimics (200nM)組心臟成纖維細胞的增殖比例也升高。在體外分別轉(zhuǎn)染-208a inhibitors和inhibitors control 8h,再以Ang Ⅱ(100 nM)干預心臟成纖維細胞24h。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)miR-208a inhibitor (200nM)組a-SMA和Ⅰ型膠原蛋白水平較對照組下降,FCM分析發(fā)現(xiàn)miR-208a inhibitors(200nM)組心臟成纖維細胞增殖明顯減少。該結(jié)果提示：miR-208a促進心臟成纖維細胞的增殖分化,這可能是miR-208a促進心肌纖維化的重要原因之一。7.下調(diào)NLK抑制心臟成纖維細胞的增殖和分化在心臟成纖維細胞中分別轉(zhuǎn)染siRNA-NLK和siRNA control 8h, Ang Ⅱ (100nM)干預24h。qRT-PCR和western blot檢測發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ上調(diào)NLK mRNA和蛋白表達,siRNA-NLK組NLK mRNA和蛋白表達顯著降低。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)siRNA-NLK組a-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達減少,FCM分析發(fā)現(xiàn),siRNA-NLK組心臟成纖維細胞增殖較對照組明顯降低,抑制NLK減少了心臟成纖維細胞的增殖分化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：1589048