本文選題：Interleukin-24　切入點：基因轉(zhuǎn)染　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：高血壓是導(dǎo)致心血管疾病高死亡率的重要因素,可以通過多種機制導(dǎo)致終末目標(biāo)組織器官如心臟、腦組織、腎臟、肝臟和血管的損傷,降壓治療可以明顯的預(yù)防和降低心血管不良事件的發(fā)生,所以降壓治療有著重要的意義。高血壓各種復(fù)雜的病理生理機制有一個共同點就是活性氧的利用度增加,即氧化應(yīng)激�；钚匝踉谛难芟到y(tǒng)中調(diào)控血管內(nèi)皮功能,參與血管內(nèi)皮炎癥、增殖、遷移、凋亡、血管生成等過程�；钚匝醍a(chǎn)生增強,以及抗氧化系統(tǒng)作用功能的減弱,結(jié)果可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和功能異常,這是導(dǎo)致與血管內(nèi)皮作用關(guān)系密切的,如高血壓、動脈粥樣硬化等疾病的重要原因。對于血管內(nèi)皮細胞損傷的治療和修復(fù)保護,目前有學(xué)者將其視為降壓治療的終點,和疾病發(fā)展轉(zhuǎn)歸的危險預(yù)測信號,所以,研究血管內(nèi)皮細胞的損傷與保護對于疾病預(yù)測和療效觀察意義重大。有研究發(fā)現(xiàn)抗高血壓藥物可以導(dǎo)致腎臟、膀胱、心臟、腦和肝臟組織基因表達改變,除了既往明確與心血管疾病有關(guān)的基因以外,還包括16種未曾在心血管疾病中發(fā)現(xiàn)的基因表達改變,其中包括白介素24(IL-24)基因,組織蛋白酶Z(Cathepsin Z,Ctsz)基因等。這些差異表達基因可能是潛在的生物標(biāo)志物,以及心血管疾病防治新靶點,可能為該領(lǐng)域相關(guān)疾病治療的發(fā)展提供有價值的信息。IL-24基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因,國內(nèi)外很多研究已經(jīng)證明它在多種腫瘤生長轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮治療作用。一系列發(fā)病分子機制在腫瘤和心血管是共同的,吸煙產(chǎn)生的有毒物質(zhì)代謝和飲食中脂肪攝入量增加,都可以引起該兩種病理過程有關(guān)的共同發(fā)病分子機理——即氧化應(yīng)激和細胞損傷。動脈粥樣硬化的發(fā)病可能源于損傷、感染所致的變異或轉(zhuǎn)換單一的動脈平滑肌細胞的祖增殖克隆,類似于目前最廣泛持有的致癌發(fā)生理論。細胞增殖相關(guān)的調(diào)節(jié)通路參與動脈粥樣斑塊進展,脈管的病理性狹窄與癌侵襲進展。細胞間粘附分子性狀改變可以參與到斑塊和血栓的形成,以及腫瘤擴散轉(zhuǎn)移等病理過程。結(jié)合蛋白酶表達的改變可以參與到溶栓治療,動脈粥樣硬化斑塊擴張和出血,以及惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。鑒于二者發(fā)病機制的共同點,一些新型的治療策略可以同時針對心血管疾病和癌癥,即針對心血管疾病和癌癥的共同發(fā)病分子機制有著類似的治療策略,主要包括減弱氧化應(yīng)激損傷、使用抗炎劑減少趨化因子,細胞活素和生長因子的細胞信號、抑制細胞增殖、抗血管生成以延緩動脈硬化和癌癥斑塊擴張浸潤轉(zhuǎn)移、使用放射治療等方面�？紤]IL-24基因的生物學(xué)作用涉及到心血管疾病和癌癥新型治療策略的多個方面,我們推測其對高血壓等心血管疾病的發(fā)病分子機制也有潛在的治療作用,以及與高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系,以及與降壓藥物治療具有相關(guān)性。在細胞實驗部分,我們研究IL-24基因表達是否對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷具有保護作用及作用機制,通過利用脂質(zhì)體介導(dǎo)外源性導(dǎo)入重組質(zhì)粒p DC-316-IL-24至體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC),轉(zhuǎn)染后24小時利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR檢測目的基因表達情況,轉(zhuǎn)染成功后給予不同濃度過氧化氫損傷,利用增殖實驗觀察IL-24對較低濃度的過氧化氫導(dǎo)致的HUVEC異常增殖的影響作用;較高濃度過氧化氫損傷后,HUVEC細胞存活率的檢測利用細胞計數(shù)Kit-8(CCK-8)法來進行檢測,HUVEC細胞凋亡情況采用Annexin-V/PI聯(lián)合染色并流式細胞術(shù)檢測,凋亡相關(guān)Cleaved caspase-3的表達采用Western-blot方法檢測,流式細胞術(shù)及熒光探針標(biāo)記法測定細胞內(nèi)活性氧含量,western-blot方法檢測PI3K/PKB信號通路蛋白的表達,Real-time PCR和Western-blot檢測細胞中高血壓疾病相關(guān)因子Angiotensinogen(血管緊張素原)、endothelin-1(內(nèi)皮素-1)、ATRAP(血管緊張素Ⅱ1型受體相關(guān)蛋白angiotensinⅡtype 1 receptor-associated protein)、PDGF(血小板源性生長因子)RNA和蛋白表達情況。同時,基于IL-24廣泛生物學(xué)活性的理論基礎(chǔ),我們推論IL-24基因與心血管疾病可能有密切關(guān)聯(lián),且可能具有治療潛力。在本研究的動物實驗部分,我們研究IL-24表達水平變化與高血壓疾病血壓升高與降壓治療的關(guān)系。我們通過利用血管緊張素II微量滲透泵皮下埋植構(gòu)建高血壓大鼠模型,造模成功后采用Real-time PCR和Western-blot方法檢測對照組和高血壓模型組IL-24基因表達水平;穩(wěn)定升壓后一周給予高血壓模型組大鼠依那普利及硝苯地平降壓治療,血壓穩(wěn)定下降后一周同法檢測IL-24基因含量;分析IL-24基因的表達情況與血壓升降變化之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明,細胞實驗中IL-24可以明顯抑制低濃度H2O2導(dǎo)致的細胞異常增殖,降低細胞內(nèi)ROS含量,下調(diào)細胞內(nèi)活化Caspase-3水平,減少氧化應(yīng)激所致HUVEC細胞損傷,從而提高細胞存活率,降低細胞早期和晚期凋亡比率,并可以下調(diào)H2O2刺激所致高血壓發(fā)病相關(guān)因子的表達,從而減少心血管疾病的發(fā)生。IL-24可能通過活化PI3K/PKB信號通路來發(fā)揮抗氧化作用,進而影響其下游的如NF-κB、AP-1等信號通路來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能和心血管疾病并發(fā)癥的發(fā)生。動物實驗中高血壓模型大鼠器官組織IL-24表達明顯下降,降壓治療后表達升高,IL-24與高血壓疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。綜上所述,IL-24基因可以抑制HUVEC的異常增殖,活化PI3K/PKB信號通路來發(fā)揮抗氧化作用,減弱H2O2導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,保護血管內(nèi)皮細胞抵抗氧化損傷,下調(diào)細胞內(nèi)活化Caspase-3表達,減少細胞凋亡而提高存活率。同時,IL-24可以下調(diào)血管損傷后產(chǎn)生增多的與心血管疾病發(fā)病有關(guān)基因的表達,減少心血管疾病的發(fā)生,此外,IL-24可能參與依那普利和硝苯地平降壓治療的分子機制,這些結(jié)果表明IL-24基因除了具有抑癌作用,可能對于高血壓也具有治療潛力,或能作為新的治療高血壓的靶點和分子通路中的關(guān)鍵基因,然而,IL-24如何參與降壓藥物治療過程的詳細機制尚需后續(xù)研究中進一步探討�？紤]到癌癥和心血管疾病的發(fā)病共通性和IL-24對ROS誘導(dǎo)致病過程的抑制作用,IL-24可能為ROS導(dǎo)致的各種心血管疾病提供基本的干預(yù)策略。第一部分IL-24基因?qū)^氧化氫導(dǎo)致HUVEC氧化損傷的保護作用和機制研究目的:研究IL-24對H2O2所致HUVEC損傷的影響及作用機制,探討IL-24與心血管疾病的相關(guān)性。方法:人臍靜脈內(nèi)皮細胞株在37℃CO2孵箱內(nèi)正常培養(yǎng),貼壁生長狀態(tài)良好情況下進行實驗操作。細胞實驗部分分組:Ⅰ空白對照:細胞用高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+青鏈霉素雙抗中正常培養(yǎng);ⅡH2O2損傷組:該組細胞分別給予0.10,0.30mmol/L作為較低、較高終濃度的H2O2;ⅢH2O2損傷+IL-24預(yù)保護組:H2O2損傷濃度同組Ⅱ,在損傷之前先進行轉(zhuǎn)染預(yù)保護,將重組質(zhì)粒p DC316-h IL-24和Lipofectamine 2000 10μl混勻以進行轉(zhuǎn)染,重組質(zhì)粒p DC316-h IL-24與脂質(zhì)體比例(μg:μl=1:1);ⅣH2O2損傷+空質(zhì)粒組:H2O2損傷濃度同組Ⅱ,空質(zhì)粒p DC316與脂質(zhì)體比例(μg:μl=1:1);ⅤIL-24組:重組質(zhì)粒p DC316-h IL-24轉(zhuǎn)染同組Ⅲ;Ⅵ空質(zhì)粒組:p DC316轉(zhuǎn)染方法同組Ⅳ。轉(zhuǎn)染后24小時基因轉(zhuǎn)染組熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,利用RT-PCR方法確定轉(zhuǎn)染成功。利用劃痕實驗檢測IL-24對低濃度H2O2導(dǎo)致的異常增殖的抑制作用,細胞存活率采用CCK-8法檢測,活化caspase-3表達采用western-blot方法檢測,HUVEC細胞凋亡情況和細胞內(nèi)ROS水平利用流式細胞術(shù)及熒光探針標(biāo)記法測定,western-blot方法檢測PI3K/PKB信號通路蛋白的表達,Real-time PCR和Western-blot法檢測細胞內(nèi)心血管疾病相關(guān)因子RNA水平和蛋白表達情況。結(jié)果:劃痕實驗表明IL-24可以明顯抑制低濃度H2O2導(dǎo)致的細胞異常增殖,H2O2組與H2O2+IL-24組相比較,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05;IL-24可降低細胞內(nèi)ROS含量,H2O2損傷組ROS含量明顯高于其他組,與對照組和IL-24保護組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.001;IL-24保護細胞對抗氧化損傷,可以明顯減少細胞凋亡情況,下調(diào)細胞內(nèi)caspase-3的活化水平,H2O2損傷組和IL-24保護組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.001;H2O2損傷組細胞存活率最低,與對照組相比較差異明顯,P0.001,加入IL-24保護可以明顯減少氧化應(yīng)激引起的細胞損傷死亡,細胞存活率明顯提高,H2O2組與H2O2+IL-24組相比較具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異,P0.05;H2O2損傷引起的氧化應(yīng)激,刺激PI3K/PKB信號通路活性增強來發(fā)揮抗氧化作用,與未干預(yù)對照組相比較,PI3K、PKB(Akt)蛋白均表達上調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。IL-24保護組可以顯著的提高該信號通路蛋白的表達水平,且與H2O2損傷組相比較差異顯著,P0.001,從而進一步發(fā)揮抗氧化作用;IL-24還可下調(diào)H2O2刺激導(dǎo)致升高的心血管疾病相關(guān)因子Angiotensinogen、endothelin-1、ATRAP、PDGF的的表達,P0.001。結(jié)論:IL-24可以抑制HUVEC的異常增殖,保護細胞對抗氧化損傷和抗細胞凋亡,下調(diào)細胞內(nèi)活化caspase-3蛋白表達水平,提高HUVEC細胞存活率。同時,IL-24可以下調(diào)血管損傷后產(chǎn)生增多的與心血管疾病發(fā)病有關(guān)基因的表達,減少心血管疾病的發(fā)生和抑制疾病進展。IL-24可能通過活化PI3K/PKB信號通路來發(fā)揮抗氧化作用,進而影響其下游的一些因子或信號通路來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能和心血管疾病并發(fā)癥的發(fā)生�？紤]到癌癥和心血管疾病的發(fā)病共通性和IL-24對ROS誘導(dǎo)致病過程的抑制作用,IL-24基因可能為ROS導(dǎo)致的各種血管疾病提供基本的治療策略。第二部分IL-24與高血壓疾病發(fā)病及治療相關(guān)性的研究目的:探討IL-24基因與高血壓疾病發(fā)生發(fā)展和藥物降壓治療的相關(guān)性。方法:正常SD大鼠分為對照組(n=12)和高血壓模型組(n=36)。利用血管緊張素II微量滲透泵構(gòu)建高血壓大鼠模型,按照微量滲透泵使用說明和大鼠體重計算微量滲透泵用藥量【500 ng/(kg·min)】,手術(shù)操作將含藥微量滲透泵置于大鼠腹部皮下,無菌縫合,觀察大鼠生存情況,每日觀察大鼠精神狀態(tài)及血壓升高情況。血壓升高后1周處死該組部分大鼠(n=12)和對照組大鼠(n=12),取大鼠心臟和腎臟組織,Real-time PCR和Western-blot檢測IL-24基因表達含量的變化。剩余高血壓大鼠分為繼續(xù)高血壓組(n=12)和高血壓治療組(n=12)兩組,治療組給予依那普利(劑量35mg/Kg/d)和硝苯地平(劑量30mg/Kg/d)藥物治療,血壓穩(wěn)定下降后處死大鼠,Real-time PCR和Western-blot檢測大鼠心臟和腎臟組織IL-24基因表達含量的變化。結(jié)果:Real-time PCR和Western-blot檢測大鼠高血壓造模成功和降壓治療后心臟和腎臟組織中IL-24基因的RNA和蛋白水平。結(jié)果表明,高血壓造模成功后,大鼠心臟和腎臟組織的IL-24基因表達明顯下調(diào),與對照組相比較具有統(tǒng)計學(xué)差異,而降壓治療后,IL-24基因表達又會明顯升高,與未治療組比較具有明顯差異,P0.001。Western-blot結(jié)果表明,高血壓造模成功的大鼠體內(nèi)IL-24蛋白表達明顯減少,與對照組相比較,與β-actin相比,IL-24蛋白相對表達含量分別為(0.95±0.041/1.87±0.062),P0.001,對照組大鼠與高血壓組大鼠相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)過降壓治療后,IL-24基因RNA和蛋白表達明顯上調(diào),與未治療組相比較,與β-actin相比,IL-24蛋白相對表達含量分別為(1.54±0.014/0.81±0.042),P0.001,降壓治療組和未治療組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.001。結(jié)論:通過構(gòu)建高血壓模型,證明IL-24基因RNA和蛋白表達與高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切相關(guān)性,血壓升高后該基因表達下降,降壓治療可出現(xiàn)該基因的表達升高,提示IL-24可能參與依那普利和硝苯地平降壓治療的分子機制,但是IL-24如何參與降壓藥物治療過程的詳細機制尚需后續(xù)研究中進一步探討。研究結(jié)果提示IL-24基因可能對于高血壓也具有治療潛力,或能作為新的治療高血壓的靶點和分子通路中的關(guān)鍵基因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1

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本文編號：1585726