本文選題：氫生理鹽水組　切入點(diǎn)：下肢缺血再灌注　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:急性下肢缺血再灌注損傷是指短時(shí)間內(nèi)下肢急性缺血,而重新恢復(fù)其血流后導(dǎo)致下肢缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。常見于腹主動(dòng)脈瘤、急性動(dòng)脈栓塞等疾病手術(shù)治療中長時(shí)間使用夾血帶止血后再恢復(fù)血流的情況。急性下肢缺血再灌注損傷常常伴隨出現(xiàn)機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和組織損傷,甚至損害心、肺、腎和循環(huán)系統(tǒng)的生理功能。氫氣具有弱還原性,可發(fā)揮抗氧化作用,能夠有選擇性地清除羥自由基。由于氫分子較小,能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞器,因此作為缺血再灌注防治因子具有很大的優(yōu)勢,吸引了很多學(xué)者展開氫對(duì)缺血再灌注保護(hù)作用的研究。本課題以大鼠下肢急性缺血再灌注損傷為模型,擬探討氫對(duì)大鼠下肢急性缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,并初步探討其作用的機(jī)制。由于氫的氣體形式在應(yīng)用過程中存在很多問題,因此我們將采用氫生理鹽水進(jìn)行研究。目的:通過建立大鼠下肢急性缺血再灌注模型,探討氫分子對(duì)大鼠下肢急性缺血再灌注的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。為臨床上應(yīng)用氫分子緩解治療急性下肢缺血再灌注損傷提供理論基礎(chǔ)。方法:1、急性下肢缺血再灌注模型:采用游離股動(dòng)脈、股靜脈和股神經(jīng)的方法,游離股動(dòng)脈約10mm,以Bulldog無創(chuàng)血管阻斷鉗夾閉股動(dòng)脈,遠(yuǎn)端股動(dòng)脈置管測壓,血壓為零標(biāo)志缺血成功;到達(dá)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)(本研究為缺血4小時(shí))后去除動(dòng)脈夾,恢復(fù)下肢血供血壓升高標(biāo)志再灌注成功。2、長期給藥實(shí)驗(yàn)中,大鼠急性下肢缺血再灌注造模成功后第1、3、5、7、9天,稱取大鼠體重,懫用姿勢反射試驗(yàn)、肢體不對(duì)稱試驗(yàn)兩種方法作為行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo),觀察氫生理鹽水對(duì)大鼠缺血再灌注損傷后運(yùn)動(dòng)功能康復(fù)的影響。3、短期給藥實(shí)驗(yàn)中,每組大鼠于再灌注15小時(shí)后切取下肢肌肉組織及肝、肺、腎組織,經(jīng)甲醛中固定、石蠟包埋、冰凍切片獲得組織切片。4、組織損傷檢測:(1)采用he染色法進(jìn)行組織切片染色,觀察組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化和炎性浸潤。(2)運(yùn)用自動(dòng)生化分析儀檢測肌紅蛋白(mb)、脂蛋白復(fù)合物(lpc)、脂質(zhì)過氧化物(lpo)等組織壞死分解產(chǎn)物。(3)采用比色法檢測骨骼肌組織中血漿中乳酸脫氫酶(ldh)、肌酸激酶(ck)的含量。5、炎性程度檢測:采用elisa法測定各組血清中il-1、il-6、tnf-α、hmgb1的濃度。6、氧化程度檢測:采用比色法檢測組織及線粒體中mda、gsh、gssg的含量,觀察組織及線粒體氧化反應(yīng)程度。7、線粒體結(jié)構(gòu)與功能檢測:(1)差速離心法分離肌肉組織細(xì)胞線粒體及胞漿。(2)透射電鏡觀察骨骼肌細(xì)胞線粒體形態(tài)改變。(3)采用分光光度法檢測線粒體膜勢能以及線粒體中atp的變化,clark氧電極法檢測線粒體呼吸功能,觀察線粒體損傷情況。8、細(xì)胞凋亡檢測:(1)采用tunel染色法檢測骨骼肌組織細(xì)胞凋亡。(2)采用免疫印跡方法檢測組織中細(xì)胞色素c、bax、pro-caspase9和caspase3等凋亡相關(guān)蛋白的含量。結(jié)果:1、氫生理鹽水對(duì)大鼠急性下肢缺血再灌注后骨骼肌及遠(yuǎn)隔組織損傷的影響(1)組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,不管是骨骼肌還是遠(yuǎn)隔器官肝、肺、腎組織,氫生理鹽水處理的組較對(duì)照組由下肢缺血再灌注引起的組織損傷明顯減輕,可見組織形態(tài)相對(duì)完整、組織細(xì)胞凋亡壞死減少、且炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕等。(2)我們發(fā)現(xiàn)氫生理鹽水能明顯降低下肢缺血再灌注引起的骨骼肌及遠(yuǎn)隔組織中肌紅蛋白(mb)、脂蛋白復(fù)合物(lpc)、脂質(zhì)過氧化物(lpo)等組織壞死分解產(chǎn)物的升高。(3)我們還檢測到實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組大鼠血清中乳酸脫氫酶(ldh)、肌酸激酶(ck)的下降。2、氫生理鹽水對(duì)大鼠急性下肢缺血再灌注炎性反應(yīng)的影響普通生理鹽水組大鼠血清中炎性因子il-1、il-6、tnf-α、hmgb1的含量較假手術(shù)組明顯升高,而氫生理鹽水組大鼠血清中炎性因子il-1、il-6、tnf-α、hmgb1的含量較普通生理鹽水組明顯降低。3、氫生理鹽水對(duì)大鼠下肢骨骼肌缺血再灌注氧化應(yīng)激的影響下肢缺血再灌注后大鼠骨骼肌及肝、肺、腎組織中mda和gssg的水平明顯升高,而gsh的含量明顯下降,說明缺血再灌注后骨骼肌及肝、肺、腎組織中的氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng),而氫生理鹽水處理則能明顯降低mda和gssg的水平,并提高gsh的含量。說明氫生理鹽水可以有效抑制下肢缺血再灌注引起的骨骼肌及遠(yuǎn)端器官肝、肺、腎的氧化應(yīng)激。4、氫生理鹽水對(duì)大鼠缺血再灌注損傷后運(yùn)動(dòng)功能康復(fù)的影響缺血再灌注后,大鼠的姿勢反射功能受損,以第1天、第3天、第5天統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異,而第7天后,姿勢反射功能有所恢復(fù),而氫生理鹽水的處理使得大鼠姿勢反射功能受損減輕,以第3天和第5天有顯著性差異;缺血再灌注后,大鼠的肢體對(duì)稱性變差,以第1天、第3天統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異,第5天后,肢體對(duì)稱性有所恢復(fù),而氫生理鹽水的處理使得大鼠肢體對(duì)稱性受損減輕,以第3天有顯著性差異。說明氫生理鹽水可明顯改善下肢缺血再灌注引起的大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能損傷。另外,氫生理鹽水處理可使得缺血再灌注引起的大鼠體重下降明顯改善。5、氫生理鹽水對(duì)大鼠下肢缺血再灌注后骨骼肌線粒體的影響。(1)透射電鏡觀察可以看出,下肢缺血再灌注大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體形狀出現(xiàn)大小形態(tài)不規(guī)則、腫脹、線粒體嵴紊亂不清晰、線粒體基質(zhì)凝聚;而氫生理鹽水處理的大鼠缺血再灌注組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體則大小形態(tài)均勻一致、線粒體嵴及線粒體基質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)則、較少出現(xiàn)腫脹情況。(2)大鼠下肢缺血再灌注后,線粒體膜勢能相比假手術(shù)組大幅度降低,而氫生理鹽水處理組線粒體膜勢能高于對(duì)照組。這說明氫生理鹽水處理可以在下肢受到缺血再灌注時(shí)幫助線粒體維持其膜勢能,維持線粒體滲透壓平衡,保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)免受損傷。(3)通過檢測不同組大鼠下肢骨骼肌細(xì)胞線粒體中mda、gsh、gssg的含量,發(fā)現(xiàn)大鼠下肢缺血再灌注組mda、gsh、gssg的含量較假手術(shù)組明顯上升,而氫生理鹽水組較普通生理鹽水組mda、gsh、gssg的含量明顯下降。(4)大鼠下肢缺血再灌注可增強(qiáng)骨骼肌細(xì)胞線粒體中atp的消耗,增強(qiáng)線粒體的氧化反應(yīng)程度,而氫生理鹽水組大鼠線粒體中atp的消耗明顯低于普通生理鹽水組。與之一致的是,氫生理鹽水組大鼠線粒體中的磷氧比明顯高于普通生理鹽水組。6、氫生理鹽水對(duì)大鼠下肢缺血再灌注后骨骼肌組織細(xì)胞凋亡的影響(1)tunel染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組凋亡細(xì)胞較少,而相較于假手術(shù)組缺血再灌注后對(duì)照組大鼠骨骼肌組織細(xì)胞凋亡明顯增加,而氫生理鹽水處理的實(shí)驗(yàn)組相較于對(duì)照組凋亡明顯下降。(2)假手術(shù)組中,bax的表達(dá)以在細(xì)胞質(zhì)為主,而對(duì)照組中bax的表達(dá)在線粒體中顯著增強(qiáng),而在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)下降,說明下肢缺血再灌注損傷時(shí)bax可能由細(xì)胞質(zhì)像線粒體轉(zhuǎn)移,而氫生理鹽水干預(yù)后導(dǎo)致bax的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組在細(xì)胞質(zhì)中增加,在線粒體中的表達(dá)相對(duì)對(duì)照組下降。細(xì)胞色素c的表達(dá)與bax呈相反的趨勢。(3)缺血再灌注后對(duì)照組骨骼肌細(xì)胞中pro-caspase9和caspase3的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組,統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異;而氫生理鹽水處理后,骨骼肌細(xì)胞中pro-caspase9和caspase3的表達(dá)較對(duì)照組明顯下降。結(jié)論:本文運(yùn)用大鼠急性下肢缺血再灌注損傷模型,并在再灌注時(shí)進(jìn)行氫生理鹽水處理,對(duì)缺血再灌注后大鼠骨骼肌損傷、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能、細(xì)胞凋亡等進(jìn)行檢測和分析,得到以下結(jié)論:1、氫生理鹽水能明顯減輕下肢缺血再灌注誘導(dǎo)的骨骼肌及遠(yuǎn)隔器官損傷。2、氫生理鹽水能有效抑制下肢缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激。3、氫生理鹽水能有效減輕下肢缺血再灌注誘導(dǎo)的骨骼肌炎性反應(yīng)。4、氫生理鹽水能明顯改善下肢缺血再灌注后大鼠運(yùn)動(dòng)功能康復(fù)。5、氫生理鹽水能明顯減輕缺血再灌注引起的骨骼肌線粒體損傷。(1)氫生理鹽水能保護(hù)缺血再灌注時(shí)線粒體的結(jié)構(gòu)。(2)氫生理鹽水能抑制骨骼肌細(xì)胞線粒體ATP消耗、呼吸控制率及磷氧比的降低來保護(hù)線粒體的功能。6、氫生理鹽水能抑制下肢缺血再灌注引起的骨骼肌細(xì)胞凋亡。(1)氫生理鹽水能調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞中細(xì)胞色素C和凋亡蛋白Bax的表達(dá)。(2)氫生理鹽水調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞中Pro-caspase9和caspase3的表達(dá)。綜上所述,我們的研究顯示尾靜脈注射氫生理鹽水可以明顯抑制大鼠急性下肢缺血再灌注引起的細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)與功能損傷,進(jìn)而提高線粒體的抗氧化能力,抑制線粒體氧化應(yīng)激,減輕線粒體所受氧化損傷,另外,氫生理鹽水使得線粒體膜勢能得以維持,調(diào)控Bax和細(xì)胞色素C在線粒體與細(xì)胞質(zhì)中的分布,并且抑制Pro-caspase9的激活、抑制凋亡下游分子caspase3的表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡。尾靜脈注射氫生理鹽水還可以降低骨骼肌及遠(yuǎn)隔器官肝、肺、腎的氧化應(yīng)激,提高組織的抗氧化能力,并能通過抑制骨骼肌及遠(yuǎn)隔器官肝、肺、腎中的炎性細(xì)胞聚集及炎性因子釋放,顯著減輕組織的炎癥程度,從而有效保護(hù)下肢缺血再灌注引起的骨骼肌及遠(yuǎn)隔器官肝、肺、腎的功能損傷,有助于大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)且顯著改善大鼠的身體狀態(tài)。為氫生理鹽水應(yīng)用于輔助治療下肢缺血再灌注引起的損傷提供理論支持。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543

【參考文獻(xiàn)】

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1 董六一;陳志武;;心肌缺血/再灌注損傷與炎癥反應(yīng)[J];中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2008年05期

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1 都曉輝;缺血預(yù)處理和后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究[D];吉林大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1583507