本文選題：氫生理鹽水組　切入點：下肢缺血再灌注　出處：《重慶醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:急性下肢缺血再灌注損傷是指短時間內(nèi)下肢急性缺血,而重新恢復其血流后導致下肢缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象。常見于腹主動脈瘤、急性動脈栓塞等疾病手術治療中長時間使用夾血帶止血后再恢復血流的情況。急性下肢缺血再灌注損傷常常伴隨出現(xiàn)機體氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡和組織損傷,甚至損害心、肺、腎和循環(huán)系統(tǒng)的生理功能。氫氣具有弱還原性,可發(fā)揮抗氧化作用,能夠有選擇性地清除羥自由基。由于氫分子較小,能穿過細胞膜進入細胞器,因此作為缺血再灌注防治因子具有很大的優(yōu)勢,吸引了很多學者展開氫對缺血再灌注保護作用的研究。本課題以大鼠下肢急性缺血再灌注損傷為模型,擬探討氫對大鼠下肢急性缺血再灌注損傷的保護作用,并初步探討其作用的機制。由于氫的氣體形式在應用過程中存在很多問題,因此我們將采用氫生理鹽水進行研究。目的:通過建立大鼠下肢急性缺血再灌注模型,探討氫分子對大鼠下肢急性缺血再灌注的保護作用及其作用機制。為臨床上應用氫分子緩解治療急性下肢缺血再灌注損傷提供理論基礎。方法:1、急性下肢缺血再灌注模型:采用游離股動脈、股靜脈和股神經(jīng)的方法,游離股動脈約10mm,以Bulldog無創(chuàng)血管阻斷鉗夾閉股動脈,遠端股動脈置管測壓,血壓為零標志缺血成功;到達預定時間點(本研究為缺血4小時)后去除動脈夾,恢復下肢血供血壓升高標志再灌注成功。2、長期給藥實驗中,大鼠急性下肢缺血再灌注造模成功后第1、3、5、7、9天,稱取大鼠體重,懫用姿勢反射試驗、肢體不對稱試驗兩種方法作為行為學評價指標,觀察氫生理鹽水對大鼠缺血再灌注損傷后運動功能康復的影響。3、短期給藥實驗中,每組大鼠于再灌注15小時后切取下肢肌肉組織及肝、肺、腎組織,經(jīng)甲醛中固定、石蠟包埋、冰凍切片獲得組織切片。4、組織損傷檢測:(1)采用he染色法進行組織切片染色,觀察組織形態(tài)學結構變化和炎性浸潤。(2)運用自動生化分析儀檢測肌紅蛋白(mb)、脂蛋白復合物(lpc)、脂質(zhì)過氧化物(lpo)等組織壞死分解產(chǎn)物。(3)采用比色法檢測骨骼肌組織中血漿中乳酸脫氫酶(ldh)、肌酸激酶(ck)的含量。5、炎性程度檢測:采用elisa法測定各組血清中il-1、il-6、tnf-α、hmgb1的濃度。6、氧化程度檢測:采用比色法檢測組織及線粒體中mda、gsh、gssg的含量,觀察組織及線粒體氧化反應程度。7、線粒體結構與功能檢測:(1)差速離心法分離肌肉組織細胞線粒體及胞漿。(2)透射電鏡觀察骨骼肌細胞線粒體形態(tài)改變。(3)采用分光光度法檢測線粒體膜勢能以及線粒體中atp的變化,clark氧電極法檢測線粒體呼吸功能,觀察線粒體損傷情況。8、細胞凋亡檢測:(1)采用tunel染色法檢測骨骼肌組織細胞凋亡。(2)采用免疫印跡方法檢測組織中細胞色素c、bax、pro-caspase9和caspase3等凋亡相關蛋白的含量。結果:1、氫生理鹽水對大鼠急性下肢缺血再灌注后骨骼肌及遠隔組織損傷的影響(1)組織形態(tài)學結果顯示,不管是骨骼肌還是遠隔器官肝、肺、腎組織,氫生理鹽水處理的組較對照組由下肢缺血再灌注引起的組織損傷明顯減輕,可見組織形態(tài)相對完整、組織細胞凋亡壞死減少、且炎性細胞浸潤明顯減輕等。(2)我們發(fā)現(xiàn)氫生理鹽水能明顯降低下肢缺血再灌注引起的骨骼肌及遠隔組織中肌紅蛋白(mb)、脂蛋白復合物(lpc)、脂質(zhì)過氧化物(lpo)等組織壞死分解產(chǎn)物的升高。(3)我們還檢測到實驗組相對于對照組大鼠血清中乳酸脫氫酶(ldh)、肌酸激酶(ck)的下降。2、氫生理鹽水對大鼠急性下肢缺血再灌注炎性反應的影響普通生理鹽水組大鼠血清中炎性因子il-1、il-6、tnf-α、hmgb1的含量較假手術組明顯升高,而氫生理鹽水組大鼠血清中炎性因子il-1、il-6、tnf-α、hmgb1的含量較普通生理鹽水組明顯降低。3、氫生理鹽水對大鼠下肢骨骼肌缺血再灌注氧化應激的影響下肢缺血再灌注后大鼠骨骼肌及肝、肺、腎組織中mda和gssg的水平明顯升高,而gsh的含量明顯下降,說明缺血再灌注后骨骼肌及肝、肺、腎組織中的氧化應激明顯增強,而氫生理鹽水處理則能明顯降低mda和gssg的水平,并提高gsh的含量。說明氫生理鹽水可以有效抑制下肢缺血再灌注引起的骨骼肌及遠端器官肝、肺、腎的氧化應激。4、氫生理鹽水對大鼠缺血再灌注損傷后運動功能康復的影響缺血再灌注后,大鼠的姿勢反射功能受損,以第1天、第3天、第5天統(tǒng)計學有顯著性差異,而第7天后,姿勢反射功能有所恢復,而氫生理鹽水的處理使得大鼠姿勢反射功能受損減輕,以第3天和第5天有顯著性差異;缺血再灌注后,大鼠的肢體對稱性變差,以第1天、第3天統(tǒng)計學有顯著性差異,第5天后,肢體對稱性有所恢復,而氫生理鹽水的處理使得大鼠肢體對稱性受損減輕,以第3天有顯著性差異。說明氫生理鹽水可明顯改善下肢缺血再灌注引起的大鼠肢體運動功能損傷。另外,氫生理鹽水處理可使得缺血再灌注引起的大鼠體重下降明顯改善。5、氫生理鹽水對大鼠下肢缺血再灌注后骨骼肌線粒體的影響。(1)透射電鏡觀察可以看出,下肢缺血再灌注大鼠骨骼肌細胞線粒體形狀出現(xiàn)大小形態(tài)不規(guī)則、腫脹、線粒體嵴紊亂不清晰、線粒體基質(zhì)凝聚;而氫生理鹽水處理的大鼠缺血再灌注組大鼠骨骼肌細胞線粒體則大小形態(tài)均勻一致、線粒體嵴及線粒體基質(zhì)結構清晰規(guī)則、較少出現(xiàn)腫脹情況。(2)大鼠下肢缺血再灌注后,線粒體膜勢能相比假手術組大幅度降低,而氫生理鹽水處理組線粒體膜勢能高于對照組。這說明氫生理鹽水處理可以在下肢受到缺血再灌注時幫助線粒體維持其膜勢能,維持線粒體滲透壓平衡,保護線粒體的結構免受損傷。(3)通過檢測不同組大鼠下肢骨骼肌細胞線粒體中mda、gsh、gssg的含量,發(fā)現(xiàn)大鼠下肢缺血再灌注組mda、gsh、gssg的含量較假手術組明顯上升,而氫生理鹽水組較普通生理鹽水組mda、gsh、gssg的含量明顯下降。(4)大鼠下肢缺血再灌注可增強骨骼肌細胞線粒體中atp的消耗,增強線粒體的氧化反應程度,而氫生理鹽水組大鼠線粒體中atp的消耗明顯低于普通生理鹽水組。與之一致的是,氫生理鹽水組大鼠線粒體中的磷氧比明顯高于普通生理鹽水組。6、氫生理鹽水對大鼠下肢缺血再灌注后骨骼肌組織細胞凋亡的影響(1)tunel染色結果顯示,假手術組凋亡細胞較少,而相較于假手術組缺血再灌注后對照組大鼠骨骼肌組織細胞凋亡明顯增加,而氫生理鹽水處理的實驗組相較于對照組凋亡明顯下降。(2)假手術組中,bax的表達以在細胞質(zhì)為主,而對照組中bax的表達在線粒體中顯著增強,而在細胞質(zhì)中表達下降,說明下肢缺血再灌注損傷時bax可能由細胞質(zhì)像線粒體轉移,而氫生理鹽水干預后導致bax的表達相對于對照組在細胞質(zhì)中增加,在線粒體中的表達相對對照組下降。細胞色素c的表達與bax呈相反的趨勢。(3)缺血再灌注后對照組骨骼肌細胞中pro-caspase9和caspase3的表達明顯高于假手術組,統(tǒng)計學有顯著性差異;而氫生理鹽水處理后,骨骼肌細胞中pro-caspase9和caspase3的表達較對照組明顯下降。結論:本文運用大鼠急性下肢缺血再灌注損傷模型,并在再灌注時進行氫生理鹽水處理,對缺血再灌注后大鼠骨骼肌損傷、炎性反應、氧化應激、線粒體功能、細胞凋亡等進行檢測和分析,得到以下結論:1、氫生理鹽水能明顯減輕下肢缺血再灌注誘導的骨骼肌及遠隔器官損傷。2、氫生理鹽水能有效抑制下肢缺血再灌注引起的氧化應激。3、氫生理鹽水能有效減輕下肢缺血再灌注誘導的骨骼肌炎性反應。4、氫生理鹽水能明顯改善下肢缺血再灌注后大鼠運動功能康復。5、氫生理鹽水能明顯減輕缺血再灌注引起的骨骼肌線粒體損傷。(1)氫生理鹽水能保護缺血再灌注時線粒體的結構。(2)氫生理鹽水能抑制骨骼肌細胞線粒體ATP消耗、呼吸控制率及磷氧比的降低來保護線粒體的功能。6、氫生理鹽水能抑制下肢缺血再灌注引起的骨骼肌細胞凋亡。(1)氫生理鹽水能調(diào)節(jié)骨骼肌細胞中細胞色素C和凋亡蛋白Bax的表達。(2)氫生理鹽水調(diào)節(jié)骨骼肌細胞中Pro-caspase9和caspase3的表達。綜上所述,我們的研究顯示尾靜脈注射氫生理鹽水可以明顯抑制大鼠急性下肢缺血再灌注引起的細胞線粒體結構與功能損傷,進而提高線粒體的抗氧化能力,抑制線粒體氧化應激,減輕線粒體所受氧化損傷,另外,氫生理鹽水使得線粒體膜勢能得以維持,調(diào)控Bax和細胞色素C在線粒體與細胞質(zhì)中的分布,并且抑制Pro-caspase9的激活、抑制凋亡下游分子caspase3的表達,從而抑制細胞凋亡。尾靜脈注射氫生理鹽水還可以降低骨骼肌及遠隔器官肝、肺、腎的氧化應激,提高組織的抗氧化能力,并能通過抑制骨骼肌及遠隔器官肝、肺、腎中的炎性細胞聚集及炎性因子釋放,顯著減輕組織的炎癥程度,從而有效保護下肢缺血再灌注引起的骨骼肌及遠隔器官肝、肺、腎的功能損傷,有助于大鼠運動功能恢復且顯著改善大鼠的身體狀態(tài)。為氫生理鹽水應用于輔助治療下肢缺血再灌注引起的損傷提供理論支持。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 董六一;陳志武;;心肌缺血/再灌注損傷與炎癥反應[J];中國臨床藥理學與治療學;2008年05期

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1 都曉輝;缺血預處理和后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究[D];吉林大學;2013年

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