本文關(guān)鍵詞： 低密度脂蛋白 氧化修飾 巨噬細(xì)胞 脂質(zhì)筏 非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)　出處：《武漢大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是心血管系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病。氧化修飾的低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)在AS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。而且LDL一旦被氧化,無(wú)論被巨噬細(xì)胞攝取與否都會(huì)表現(xiàn)強(qiáng)烈AS效應(yīng),因此,動(dòng)脈粥樣硬化的抗氧化研究勢(shì)在必行。在體外,LDL的氧化可以被多種抗氧化劑如維生素E和丙丁酚等所完全拮抗。但在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中存在大量的抗氧化劑的情況下,LDL仍被氧化。LDL在體內(nèi)可能是被細(xì)胞膜粘附在某個(gè)封閉的微環(huán)境中,從而避開(kāi)環(huán)境中的抗氧化劑,這就使得臨床上抗氧化劑的效果不理想。在前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持下,我們推測(cè)脂質(zhì)筏就是這樣的微環(huán)境。本論文主要以基于質(zhì)譜的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)平臺(tái),研究天然LDL不同時(shí)間點(diǎn)刺激下巨噬細(xì)胞脂質(zhì)筏中蛋白的變化情況,對(duì)LDL的氧化機(jī)制進(jìn)行探討,本文的研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)方面：1.將LDL(100μg/ml)與巨噬細(xì)胞Raw264.7分別孵育5min,15min,30min。激光共聚焦檢測(cè)脂質(zhì)筏標(biāo)志分子GM1的分布情況；熒光漂白恢復(fù)技術(shù)檢測(cè)脂質(zhì)筏的流動(dòng)性；密度梯度離心分離巨噬細(xì)胞脂質(zhì)筏。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在靜息狀態(tài)下,脂質(zhì)筏的標(biāo)志性分子GM1均勻的分布在細(xì)胞膜表面,加入LDL之后GM1逐漸聚集,初步證明LDL能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)筏的形成；脂質(zhì)筏含有大量的膽固醇和長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸,因此其流動(dòng)性比普通的細(xì)胞膜要差些,于是通過(guò)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)我們也發(fā)現(xiàn)LDL刺激巨噬細(xì)胞以后,GM1熒光淬滅所需要的恢復(fù)時(shí)間也長(zhǎng)一些,這就說(shuō)明巨噬細(xì)胞在經(jīng)LDL刺激以后細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低,究其原因是LDL促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)筏的形成,使細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低。密度梯度離心分離巨噬細(xì)胞脂質(zhì)筏后,通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脂質(zhì)筏標(biāo)志蛋白Flotillin-1,Caveolin-1的分布得知6-8層為脂質(zhì)筏,BCA法檢測(cè)LDL刺激前后脂質(zhì)筏蛋白含量變化,從圖2-4我們可以看出,在LDL刺激后,分離得到的脂質(zhì)筏中蛋白含量始終是高于未刺激組,正是由于LDL的刺激促進(jìn)某些分子轉(zhuǎn)位進(jìn)入到脂質(zhì)筏中。2.為了研究哪些分子在LDL的刺激下轉(zhuǎn)位進(jìn)入脂質(zhì)筏中,采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)脂質(zhì)筏相關(guān)蛋白進(jìn)行分析。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO條目富集分析以及蛋白相互作用分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)筏相關(guān)蛋白呈現(xiàn)出4種變化模式：(1)180個(gè)蛋白在LDL不同時(shí)間點(diǎn)刺激下其在脂質(zhì)筏中的含量均上升；(2)63個(gè)蛋白含量在LDL刺激5分鐘或者15分鐘下調(diào),隨后又上升；結(jié)果見(jiàn)附表一；(3)147個(gè)蛋白在LDL不同時(shí)間點(diǎn)刺激下其在脂質(zhì)筏中的含量均下調(diào)；(4)48個(gè)蛋白的含量在LDL刺激5分鐘或者15分鐘上升,隨后又下調(diào)。涉及氧化還原、脂質(zhì)分解過(guò)程、白細(xì)胞粘附、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、白細(xì)胞趨化、脂質(zhì)堆積、內(nèi)吞、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、生物粘附、氧化應(yīng)激等過(guò)程顯著富集。而通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)分析,建立了差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,許多蛋白的相互作用引起我們高度關(guān)注,如ERp29與calreticulin。本章中對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析為后面篩選與LDL氧化相關(guān)的蛋白奠定基礎(chǔ)。3.基于脂質(zhì)筏蛋白質(zhì)組學(xué)的LDL氧化相關(guān)因子的篩選及功能研究。從LDL粘附于巨噬細(xì)胞到酶的激活,并經(jīng)分泌找到LDL對(duì)其進(jìn)行氧化,這之間的生物化學(xué)過(guò)程大致分為3個(gè)部分：(1)LDL的粘附,(2)信號(hào)傳導(dǎo),(3)酶的激活及定向分泌。我們按照以上3個(gè)生物化學(xué)過(guò)程篩選LDL氧化相關(guān)蛋白,最終確定ERp29作為目標(biāo)分子。首先采用免疫印跡驗(yàn)證質(zhì)譜數(shù)據(jù)的可靠性,再利用siRNA的方法探討ERp29與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的LDL氧化之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：用p-環(huán)糊精來(lái)破壞巨噬細(xì)胞脂質(zhì)筏結(jié)構(gòu)后,其氧化LDL的能力下降并且抑制了ERp29蛋白向脂質(zhì)筏的轉(zhuǎn)位,初步證明了脂質(zhì)筏對(duì)LDL的氧化以及ERp29蛋白的轉(zhuǎn)位是必須的,隨后,我們利用siRNA下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ERp29的表達(dá),圖4-3A顯示,siRNA干擾后的巨噬細(xì)胞的氧化LDL的能力下降,表現(xiàn)為T(mén)BARS值在細(xì)胞與LDL孵育24時(shí)明顯減少,進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)ERp29能夠通過(guò)抑制Nox2向脂質(zhì)筏的轉(zhuǎn)位來(lái)影響NADPH酶的裝配從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,最終引起巨噬細(xì)胞介導(dǎo)LDL氧化能力的下降。
[Abstract]:鍔ㄨ剦綺ユ牱紜寲(Atherosclerosis, AS)鏄績(jī)琛，

本文編號(hào)：1544930