發(fā)布時間：2018-02-24 00:40

  本文關(guān)鍵詞： 穿孔素 FHL2 發(fā)病機(jī)制 EBV-DNA 全外顯子組測序 PCDH18 FHL2 活化 凋亡 二次打擊 發(fā)病年齡 遺傳缺陷 EBV-DNA 家系圖譜 遲發(fā) HLH-2004　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[目的】尋找具有同樣的穿孔素基因突變的同胞卻有不同的發(fā)病狀態(tài)(一個發(fā)病而另一個完全健康)的原因,探索該疾病其他可能的發(fā)病機(jī)制�！痉椒╙以成人家族性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥2型(FHL2)患者及家屬為研究對象,搜集臨床資料,完善分子生物學(xué)、免疫學(xué)檢測及全外顯子組測序,并對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析尋找潛在的導(dǎo)致疾病發(fā)生的額外突變。[結(jié)果】通過搜集臨床資料和檢測NK細(xì)胞活性、EBV-DNA、穿孔素、HLH二代測序等確診患者為FHL2,對患者父母、胞弟及兒子進(jìn)行穿孔素一代測序描繪出家系圖譜。FHL2患者及其無癥狀的弟弟均有PRF1雜合錯義突變(c.916GA)和雜合框移突變(c.65delC)。通過全外顯子組測序,我們發(fā)現(xiàn)FASTKD3, HOXA10和SVEP1基因雜合自發(fā)性體細(xì)胞突變僅存在于先證者中。對于生殖系突變,隱性疾病遺傳模式分析得出PCDH18, CKD11B, MAGEC1,NOS1和PPP1R14BP3基因,顯性疾病遺傳模式分析得出MLL3, PCDH18, ANKRD36,HNRNPC, PCMTD1和MAGEC1基因；很明顯,PCDH18基因是兩種分析模式共有的基因,且僅有先證者PCDH18 (c.3017CT)基因突變?yōu)榧兒贤蛔?其家屬均為雜合突變,而且Polyphen-2軟件預(yù)測該突變可能有害。[結(jié)論]本研究是第一次應(yīng)用全外顯子組測序技術(shù)來探索導(dǎo)致FHL2發(fā)病的潛在“二次打擊”機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)了一個新的PRF1雜合突變組合(c.916GA和c.65delC)。唯獨(dú)在先證者中發(fā)現(xiàn)純合的生殖系突變PCDH18(c.3017CT)強(qiáng)烈支持除穿孔素外存在“二次打擊”生殖系突變,可能是誘發(fā)FHL2發(fā)生的重要機(jī)制。[目的]初步探索針對FHL2家系的全外顯子組測序篩選出的PCDH18 (S1006L)突變在FHL2發(fā)生中的可能機(jī)制。[方法]通過PyMOL軟件預(yù)測PCDH18突變對蛋白三維結(jié)構(gòu)的影響,并計(jì)算突變前后吉布斯自由能的變化。構(gòu)建PCDH18野生型和突變型質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293細(xì)胞及HepG2細(xì)胞來觀察突變對轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平的影響,轉(zhuǎn)染CTLL-2細(xì)胞并觀察突變對細(xì)胞活化和凋亡的影響。免疫組化檢測先證者標(biāo)本中PCDH18蛋白水平與其無癥狀的弟弟及正常對照的差異。[結(jié)果]我們使用PyMOL軟件構(gòu)建出野生型和突變型(S1006L) PCDH18蛋白三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)PCDH18突變導(dǎo)致氨基酸由絲氨酸置換為亮氨酸,由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?且氫鍵數(shù)目減少,突變域可能被強(qiáng)烈改變,導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定;該突變引起的吉布斯自由能改變(△△G)為8.08 kcal/mol (2 kcal/mol),也提示該突變導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。將野生型、突變型(S1006L)和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和HepG2細(xì)胞檢測轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化,結(jié)果提示轉(zhuǎn)錄水平變化不大,而突變組PCDH18蛋白量明顯減低。為研究該突變對細(xì)胞功能的影響,我們將野生型、突變型(S1006L)和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CTLL-2細(xì)胞,結(jié)果提示過表達(dá)野生型質(zhì)粒對CTLL-2細(xì)胞的活化有抑制作用(無論是否加用rIL-2),對細(xì)胞凋亡有增強(qiáng)作用,而突變型質(zhì)粒則會抵消掉活化抑制和凋亡增強(qiáng)的效應(yīng)。免疫組化結(jié)果提示先證者PCDH18的蛋白水平比其無癥狀的胞弟及正常對照組均要低。[結(jié)論]通過功能學(xué)研究我們發(fā)現(xiàn),S1006L突變能夠引起蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,蛋白量減低,可能使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞活化增強(qiáng)、凋亡受阻,協(xié)同穿孔素基因突變一起導(dǎo)致FHL2的發(fā)生。[目的]：為研究遲發(fā)性FHL患者發(fā)病年齡與遺傳缺陷及EBV感染間的相關(guān)關(guān)系。[方法]：搜集臨床懷疑HLH的患者臨床資料,結(jié)合臨床經(jīng)過、HLH二代測序等結(jié)果識別出遲發(fā)性FHL,并對其家系進(jìn)行調(diào)查,繪制家系圖譜,檢測家系中各成員的EBV-DNA。采用R語言繪制發(fā)病年齡與遺傳缺陷及EBV感染間的相關(guān)關(guān)系圖。[結(jié)果]：根據(jù)HLH患者臨床資料、HLH-2004方案治療療效、HLH二代測序結(jié)果鑒定出4例遲發(fā)性FHL,并對該4例FHL患者進(jìn)行家系調(diào)查,繪制出遺傳圖譜。采用R語言繪制出的發(fā)病年齡與遺傳缺陷及EBV感染間相關(guān)關(guān)系圖顯示,具有相似遺傳缺陷的患者,EBV-DNA拷貝數(shù)越高則發(fā)病年齡越小,反之亦然：具有相似EBV-DNA拷貝數(shù)的患者,遺傳缺陷程度越強(qiáng),則發(fā)病年齡越小,反之亦然。因此,遲發(fā)性FHL患者的發(fā)病年齡是由遺傳缺陷程度和EBV病毒感染程度共同決定的。[結(jié)論]：遲發(fā)性FHL患者發(fā)病年齡取決于本身的遺傳缺陷程度及EBV病毒感染的程度,遺傳缺陷較顯著,EBV-DNA拷貝數(shù)較高,則發(fā)病年齡較�。贿z傳缺陷較緩和或EBV-DNA拷貝數(shù)相對較低或同時具備兩者,則發(fā)病延遲。部分具有遺傳缺陷者,若無外界誘因,可能會終身不發(fā)病。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R55

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本文編號：1528233