本文關鍵詞： 心肌細胞 HMGB1 PI3Kγ Akt 糖尿病　出處：《江蘇大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是因胰島素絕對或相對分泌不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低而造成蛋白質(zhì)、脂肪水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征,其中以高血糖為主要標志,最后可造成體內(nèi)多種器官的慢性損傷和功能損害。臨床上主要將糖尿病患者分為四大類即I型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、其他類型糖尿病及妊娠糖尿病。據(jù)統(tǒng)計,現(xiàn)階段全球糖尿病人數(shù)正在迅速增加,而且估計2025年全球糖尿病患者將會增加至30億。急劇增加的糖尿病患病人數(shù)也導致了心血管疾病發(fā)病率的持續(xù)攀升。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是伴隨著糖尿病代謝異常所發(fā)生的大范圍心肌結構改變的一類獨立的特異性心肌病,它以左心室的擴大和彌漫性心室壁運動的減低,特別是舒張功能的減弱為主要特點。目前關于糖尿病人出現(xiàn)心肌功能受損的分子機制尚不十分清晰。心肌肥厚和心肌纖維化是DCM的一個突出特點。DCM患者在早期就會出現(xiàn)了心臟舒張功能不全的改變。隨著疾病的發(fā)展,心臟收縮和舒張功能障礙同時出現(xiàn)。學者提出了很多造成DCM患者心肌結構和功能改變的分子機制。很多科學研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病小鼠模型中,并發(fā)DCM小鼠的心肌組織中聚集了更多的細胞因子,提示了炎癥反應參與了 DCM的發(fā)生發(fā)展過程。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)一種廣泛地存在于哺乳動物中的高度保守的DNA結合蛋白。HMGB1可在免疫細胞或其他人體細胞受到外界刺激活化后從核內(nèi)以主動方式釋放至細胞質(zhì)或由壞死細胞破裂以被動方式釋放到胞外,引起炎癥反應和調(diào)控相關信號的傳導。同時,有研究報道,HMGB1還在心臟中發(fā)揮著心肌細胞和成纖維細胞交流紐帶的作用,它可以使成纖維細胞的炎癥因子IL-33下調(diào),從而增加其膠原蛋白表達并促進糖尿病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程,最終導致心臟功能異常。我們前期研究結果表明,在高糖環(huán)境下,心肌細胞可以增加HMGB1的表達和主動分泌。本實驗我們旨在討論高糖環(huán)境下心肌細胞表達和分泌HMGB1蛋白增多的細胞內(nèi)信號通路。方法本研究分成兩個部分。第一部分,分離大鼠的乳鼠心肌細胞并建立糖尿病高血糖細胞模型。用高糖DMEM(30mM)刺激細胞,以5.5mM葡萄糖+24.5mM甘露醇作為高滲對照,通過Western Blot觀察心肌細胞內(nèi)PI3Kγ、Akt的活化,以及用Western Blot和ELISA的方法檢測心肌細胞HMGB1的表達及分泌。通過檢測高糖對心肌細胞不同干預時間的影響,確定高糖對心肌細胞的干預時間。第二部分,應用抑制劑和基因調(diào)控手段,研究糖尿病高血糖細胞高表達HMGB1的分子機制。分別運用 PI3Kγ 抑制劑(AS 605240)及 PI3-kinase p110γ CRISPR/Cas9 Knock Out質(zhì)粒進行基因干擾,以及用Akt抑制劑(A6730)和siRNA轉(zhuǎn)染手段證明PI3Kγ/Akt通路與HMGB1之間的調(diào)節(jié)關系。用DCFDA Cellular ROS Detection試劑盒檢測高糖刺激后引起的氧化應激反應。并用抗氧化劑Mitotempo來抑制ROS的產(chǎn)生,從而觀察氧化應激與PI3Kγ/Akt通路激活的關系。結果及結論1、高糖環(huán)境下,心肌細胞中PI3Kγ/Akt活化增加,表達和分泌HMGB1蛋白顯著升高。2、高糖環(huán)境下,PI3Kγ/Akt通路正向調(diào)控HMGB1表達。3、高糖環(huán)境下,氧化應激反應增加。抗氧化劑Mitotempo能抑制高糖引起的氧化應激反應,從而減弱PI3Kγ/Akt通路活化,進而抑制下游蛋白HMGB1的表達。綜上所述,本研究采用高糖誘導的糖尿病高血糖細胞模型,對DCM時心肌細胞高表達HMGB1進行了系統(tǒng)的研究。綜合運用抑制劑和基因干擾手段,揭示了高糖誘導產(chǎn)生的氧化應激介導PI3Kγ/Akt通路的激活調(diào)控HMGB1表達和分泌增多的分子機制。
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【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R542.2

【參考文獻】

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1 Fu-Cai Wang;Jing-Xuan Pei;Jun Zhu;Nan-Jin Zhou;Dong-Sheng Liu;Hui-Fang Xiong;Xiao-Qun Liu;Dong-Jia Lin;Yong Xie;;Overexpression of HMGB1 A-box reduced lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation via HMGB1/TLR4 signaling in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2015年25期

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本文編號：1494138