本文關(guān)鍵詞： 缺血再灌注損傷 戊二醛聚合豬血紅蛋白(pPolyHb) 大鼠H9C2心肌細(xì)胞 血紅素加氧酶-1 線粒體自噬　出處：《西北大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：急性缺血性心血管疾病是指由血管內(nèi)形成的血栓或栓塞引起急性器官循環(huán)障礙造成組織損害的一類疾病。臨床表現(xiàn)為急性缺血性心力衰竭、不同程度的心絞痛和心肌梗死等癥狀。發(fā)病率和死亡率僅次于癌癥,僅有少數(shù)急性病人可在發(fā)病3小時(shí)以內(nèi)被確診并接受血管再通治療。95%以上的病人因其病程/病情發(fā)展,喪失了進(jìn)行最佳的血管再通治療機(jī)會(huì)。另外隨時(shí)間的推移即使打開栓阻,由于血和氧的突然增加也會(huì)造成缺血再灌注損傷。因此,治療急性缺血性心腦血管疾病的核心是在最短的時(shí)間內(nèi)給被阻塞的組織和器官及時(shí)提供氧份以減少由于缺氧所造成的器官和組織壞死,保護(hù)缺氧的組織和器官,延長最佳治療時(shí)間;同時(shí)也要控制氧的供應(yīng)量以避免溶栓時(shí)的再灌注所引起的氧、炎性因子和自由基等所引起的再灌注損傷。目前,臨床上主要采用針對(duì)時(shí)間窗內(nèi)的溶栓和疏通梗阻的一些方法,如溶拴劑和支架介入治療,而缺乏在最短時(shí)間內(nèi)對(duì)缺氧組織直接供氧的藥物。血紅蛋白類氧載體(Hemoglobin-based oxygen carriers,HBOCs)是在游離的去膜無基質(zhì)血紅蛋白分子基礎(chǔ)上,添加交聯(lián)劑或者聚合劑,形成分子內(nèi)交聯(lián)或者分子間聚合的一類具有類似于紅細(xì)胞攜氧釋氧以及擴(kuò)容功能的的大分子聚合物。具有無需交叉配型、便于運(yùn)輸、穩(wěn)定儲(chǔ)存、且不易受病毒微生物感染等一系列優(yōu)點(diǎn),具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)室采用的戊二醛聚合豬血紅蛋白(polymerized porcine hemoglobin),是在豬血紅蛋白分子基礎(chǔ)上添加戊二醛交聯(lián)劑合成的一種血紅蛋白類氧載體,因其遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于紅細(xì)胞(7-8um)的分子直徑,僅為20nm左右,當(dāng)血管發(fā)生病變形成栓塞時(shí),其可通過血管腔內(nèi)的狹窄間隙,及時(shí)為缺血區(qū)域的細(xì)胞和組織供氧。此外,pPolyHb含有heme基團(tuán),heme被報(bào)道可誘導(dǎo)血紅素加氧酶HO-1的合成,HO-1具有抗氧化應(yīng)激與抗炎能力,此外,缺血/再灌時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS導(dǎo)致線粒體功能障礙,進(jìn)一步損傷細(xì)胞。因此,功能紊亂的線粒體必須得以及時(shí)清除以減少ROS的大量生成。研究發(fā)現(xiàn),線粒體自噬能夠有效清除功能紊亂的線粒體以及過量產(chǎn)生的ROS,確保細(xì)胞內(nèi)線粒體功能正常穩(wěn)定。本論文首先選擇大鼠H9C2心肌細(xì)胞系建立細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型,根據(jù)MTT分別檢測(cè)pPolyHb對(duì)于正常細(xì)胞以及缺氧復(fù)氧細(xì)胞存活率的影響,檢測(cè)細(xì)胞上清液中的LDH和CK活性,選擇最適pPolyHb1OuM和20uM兩個(gè)濃度組,建立缺血再灌注損傷模型;其次,探究pPolyHb對(duì)H9C2細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響,主要檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-1β、抗炎性因子IL-10的表達(dá),采用Annexin V-FITC法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率,western blot檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bcl-2和CytC以及HO-1的表達(dá)水平;最后為了揭示pPolyHb對(duì)H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中線粒體自噬的誘導(dǎo)分子機(jī)制,檢測(cè)線粒體自噬蛋白Parkin、Pink1表達(dá)的變化以及線粒體自噬抑制后細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,pPolyHb能夠有效提高缺氧復(fù)氧后細(xì)胞生存活力,細(xì)胞毒性檢測(cè)指標(biāo)LDH以及損傷指標(biāo)CK活性相較于缺血再灌注損傷I/R組呈明顯降低趨勢(shì),并且pPolyHb能夠有效恢復(fù)缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞生長形態(tài)。AnnexinV-FITC法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示pPolyHb能夠改善細(xì)胞凋亡,減輕心肌缺血再灌注損傷,凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和CytC的表達(dá)水平顯示,pPolyHb復(fù)氧后能夠提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),同時(shí)降低促凋亡蛋白CytC和Bax的表達(dá)量,減輕心肌缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡,同時(shí),pPolyHb可降低炎性因子TNF-α、IL-1β、以及升高IL-10的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用,并且能夠通過誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)參與心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷保護(hù)作用的調(diào)節(jié)。此外,線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin表達(dá)結(jié)果顯示,pPolyHb復(fù)氧后,能夠有效誘導(dǎo)這兩種蛋白的表達(dá),并隨著復(fù)氧時(shí)間的延長,蛋白表達(dá)量逐漸降低;采用線粒體分裂抑制劑抑制線粒體自噬后,結(jié)果顯示細(xì)胞抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2含量下降,促凋亡蛋白Bax、CytC表達(dá)上升,證實(shí)pPolyHb復(fù)氧可能通過激活適度的線粒體自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而緩解缺血再灌注損傷。
[Abstract]:The invention relates to a hemoglobin oxygen carrier which is prepared by adding a crosslinking agent or a polymerization agent to the tissues and organs blocked in a time window to reduce oxygen , inflammatory factors and free radicals caused by reperfusion in the shortest time . The results showed that pPolyHb can improve the expression of Bcl - 2 , Bax , Bcl - 2 and CytC . The results show that pPolyHb can improve the expression of anti - apoptotic protein Bcl - 2 and decrease the expression level of apoptosis - related protein Bax , Bcl - 2 and CytC .

【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54

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