本文關(guān)鍵詞：ApoM通過抑制NF-κB活性下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是臨床常見的慢性炎癥性疾病,炎癥和免疫反應(yīng)是其重要的發(fā)病機(jī)制。高密度脂蛋白(high-density lipoproteins, HDL)是參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵脂蛋白,具有重要的抗AS作用。已有研究證實(shí)HDL在動脈硬化形成中還發(fā)揮重要的抗炎、抗氧化作用。載脂蛋白M (apolipoprotein M, apoM)是新近發(fā)現(xiàn)的一種與HDL功能和作用密切相關(guān)的載脂蛋白,這主要與apoM影響前β-HDL的形成有關(guān)。在成人,apoM主要表達(dá)在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞和腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞中。大量研究表明,apoM代謝異常與脂質(zhì)代謝、糖尿病、冠心病及AS等疾病的發(fā)病機(jī)制有高度相關(guān)性。近年來,apoM在炎癥疾病中的作用也受到了廣泛的關(guān)注。已有研究表明,采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、酵母聚糖或松節(jié)油等刺激炎癥小鼠模型后,小鼠的肝臟臟和腎臟中apoM的mRNA表達(dá)水平顯著下降。另有研究表明,apoM的分泌和表達(dá)在細(xì)菌性感染和慢性HIV感染患者血清中均出現(xiàn)減少,提示apoM可作為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白。此外,研究人員還發(fā)現(xiàn),apoM對異丙酚的抗炎作用起到促進(jìn)作用,異丙酚可抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中多種炎性因子的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用,而apoM能以肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α, HNF-1α)依賴型方式加強(qiáng)此抗炎效應(yīng)。近期的動物研究發(fā)現(xiàn)apoM能抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織中細(xì)胞間粘附因子(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和血管細(xì)胞粘附因子(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)的表達(dá)。這些研究說明apoM參與了炎癥反應(yīng)過程,但apoM參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制目前尚不明確。核因子-κB (nuclear factor-icB, NF-κB)是一種多效性的核蛋白因子。它通過特異性結(jié)合于免疫球蛋白K輕鏈基因增強(qiáng)子區(qū)域的κB序列而具備廣泛的生物學(xué)活性,如參與免疫炎癥反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖分化等。然而,NF-κB自身活化還可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá),如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和白介素-6 (Interleukin-6, IL-6),在動脈粥樣硬化等多種慢性炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。在經(jīng)典的NF-κB炎性信號通路中,NF-κB以非活化狀態(tài)與其抑制因子(inhibitor of NF-κB α)IκBα相結(jié)合形成復(fù)合物,感染、炎癥等刺激因素能使IκBα發(fā)生磷酸化或降解,進(jìn)而引起NF-κB活化并轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核內(nèi),誘發(fā)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄激活及炎癥損傷反應(yīng)的發(fā)生。腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)是炎癥反應(yīng)過程中重要的致病成分,參與多種炎癥性疾病的發(fā)生,細(xì)胞或組織在其刺激下可誘導(dǎo)ICAM-1和VCAM-1等表達(dá)。ICAM-1和VCAM-1作為重要的粘附因子,其異常表達(dá)和失調(diào)引起多種細(xì)胞聚集在炎癥部位進(jìn)而加重機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)。研究表明,TNF-α所引起的粘附分子表達(dá)增加與NF-κB炎性信號途徑活化密切相關(guān)。然而,NF-κB在介導(dǎo)TNF-a所誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的具體分子機(jī)制目前尚不明確,apoM是否通過影響NF-κB信號途徑進(jìn)而影響炎癥因子表達(dá)還不清楚。為進(jìn)一步探討apoM的抗炎機(jī)制,本研究以肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞為研究對象,首先采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)觀察TNF-a處理細(xì)胞后,細(xì)胞中apoM, ICAM-1, VCAM-1和IκBα的表達(dá)變化,然后檢測apoM對ICAM-1, VCAM-1和IκBα表達(dá)的影響,最后以siRNA-apoM和／或TNF-a分別作用于HepG2細(xì)胞,觀察apoM對TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞中ICAM-1, VCAM-1和IκBα表達(dá)以及NF-κB活性變化的影響,以進(jìn)一步明確apoM在慢性炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎作用可能的分子機(jī)制。目的1).觀察TNF-a對HepG2細(xì)胞中ICAM-1,VCAM-1,apoM及IκBα表達(dá)的影響；2).觀察在HepG2細(xì)胞中,apoM對ICAM-1, VCAM-1以及IκBα表達(dá)的影響；3).觀察在TNF-a處理的HepG2細(xì)胞中,apoM對ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響是否通過調(diào)節(jié)NF-κB活性而實(shí)現(xiàn)。材料和方法1.主要材料TNF-a購自美國Sigma公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒(SYBR(?) Premix Ex TaqTM II kit)和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript(?) RT Reagent kit)均購自日本TaKaRa公司；TRIzol和Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen 公司。2.細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購自美國ATCC; HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中,將細(xì)胞置于37-C、5% CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。3.RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書用TRIzol (Invitrogen)等試劑提取培養(yǎng)細(xì)胞中的總RNA。然后將總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在ABI7500 FAST熒光定量PCR系統(tǒng)上,按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本同時(shí)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,所得數(shù)據(jù)以人GAPDH基因作為內(nèi)參進(jìn)行相對定量分析。反應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)為Ct,按照△△Ct方法計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)變化。4. Western Blot分析根據(jù)總蛋白提取試劑盒說明書提取HepG2細(xì)胞的總蛋白,采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量,以每個(gè)上樣孔按照30μg計(jì)算上樣體積。然后在制備的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳,孵育一抗抗體：anti-β-actin,anti-appM,anti-ICAM-1, anti-VCAM-1和anti-IκBα抗體(Abcam),4℃孵育過夜,孵育后用辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗兔IgG二抗抗體孵育,最后采用增強(qiáng)化學(xué)顯色方法(ECL)進(jìn)行曝光顯影。5. siRNA-apoM轉(zhuǎn)染apoM特異性小干擾片段(siRNA-apoM)購自廣州銳博生物科技有限公司。轉(zhuǎn)染前一天,將HepG2細(xì)胞按照適量細(xì)胞數(shù)接種到含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的6孔板中,以次日細(xì)胞達(dá)30%-50%密度為宜。采用5gL脂質(zhì)體Lipo2000轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。置于37℃、5% CO2、飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí)后,采用Western Blot技術(shù)檢測目的基因蛋白表達(dá)情況。6.慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建帶有GFP的慢病毒過表達(dá)載體LV-Mock和LV-apoM。將HepG2細(xì)胞按照適量細(xì)胞數(shù)接種到含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的6孔板中,以次日細(xì)胞達(dá)30%-50%密度為宜。置于37℃、5% C02、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日,以慢病毒感染HepG2細(xì)胞病毒感染指數(shù)(MOI)為20進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將4μLPolybrene (8mg/mL)與稀釋好的病毒液同時(shí)加入細(xì)胞中,輕輕搖勻,然后置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染6-24小時(shí)更換新的培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染后96小時(shí)收集細(xì)胞檢測目的基因蛋白水平的表達(dá)。7. NF-κB活性檢測在siRNA-apoM和TNF-α處理HepG2細(xì)胞后提取細(xì)胞核蛋白,對提取的蛋白采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。將樣本加入到孵育有雙鏈DNA(double-stranded DNA, dsDNA)生物素的ELISA板,在酶標(biāo)儀450nm波長處讀取光密度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算NF-κB的含量。8.統(tǒng)計(jì)方法所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以x±s表示,獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn),各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1. TNF-a下調(diào)HepG2細(xì)胞apoM及IκBα達(dá),上調(diào)ICAM-1和VCAM-1表達(dá)TNF-α是一種重要的炎性介質(zhì),首先我們觀察了TNF-α對HepG2細(xì)胞中apoM, IκBα, ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響,我們以O(shè)ng/mL和lOng/mL的TNF-a分別處理HepG2細(xì)胞,采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞中apoM, IκBα, ICAM-1和VCAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,]NF-α處理組HepG2細(xì)胞中apoM mRNA和蛋白表達(dá)水平以及IKBα蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),而ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2. ApoM對IKBa, ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響ApoM是參與脂質(zhì)代謝的重要載脂蛋白,但其在炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制目前尚不明確,為進(jìn)一步研究其可能的分子機(jī)制,首先我們將構(gòu)建的apoM慢病毒過表達(dá)載體(LV-apoM)和空載對照(LV-Mock)分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后采用Western Blot技術(shù)檢測細(xì)胞中IκBα, ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)情況。Western Blot結(jié)果表明,LV-apoM轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中apoM表達(dá)升高9.9倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說明慢病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成功。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn),LV-apoM實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平分別顯著下調(diào)了57.8%和52.8%,而IκBα蛋白水平則顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3. ApoM通過抑制NF-κB活性下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)IKBα蛋白磷酸化和降解過程與NF-κB信號通路的活化密切相關(guān)。第二部分我們觀察到過表達(dá)apoM可以引起IκBα蛋白水平顯著上調(diào)。為進(jìn)一步研究apoM是否影響TNF-a誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)及其可能的分子機(jī)制,本研究采用siRNA技術(shù)靶向沉默apoM,觀察其對IKBa, ICAM-1和VCAM-1等因子表達(dá)的影響。將siRNA-apoM轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,與對照組相比,siRNA-apoM組中apoM表達(dá)顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(.P0.05)。隨之,在轉(zhuǎn)染siRNA-apoM的HepG2細(xì)胞中繼續(xù)加入Ong/mL或10ng/mL的TNF-α共孵育24小時(shí),實(shí)驗(yàn)分組如下：(1)siRNA-NC+Ong/mL TNF-α (Control組)；(2)siRNA-apoM+Ong/mL TNF-α (siRNA-apoM組)；(3) siRNA-NC+10ng/mL TNF-α (TNF-α組)；(4) siRNA-apoM+10ng/mL TNF-α (siRNA-apoM+TNF-α組)。蛋白檢測結(jié)果顯示,與Control組相比較,siRNA-apoM組中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平分別上調(diào)了93.3%和110.6%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與TNF-α組相比較,siRNA-apoM+TNF-α組細(xì)胞內(nèi)ICAM-1和VCAM-1蛋白水平則分別上調(diào)了200.8%和190.9%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)siRNA-apoM處理能進(jìn)一步增強(qiáng)TNF-α對IκBα的下調(diào)作用。提示apoM可能參與調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá),且該過程可能與NF-κB的活化密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),與Control組比較,siRNA-apoM+TNF-α組細(xì)胞中NF-κB活性上調(diào)了475.4%,而TNF-組細(xì)胞則僅上調(diào)了160%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1). TNF-α上調(diào)HepG2細(xì)胞中ICAM-1,VCAM-1表達(dá)水平,下調(diào)apoM及IκBα表達(dá)水平；2). ApoM下調(diào)HepG2細(xì)胞中ICAM-1, VCAM-1蛋白水平,上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)水平；3). ApoM通過抑制NF-κB活性進(jìn)而下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊簡;楊俊;;細(xì)胞黏附分子和動脈粥樣硬化[J];醫(yī)學(xué)綜述;2006年21期

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本文編號：1430312