本文關(guān)鍵詞：miR-146a對血小板免疫炎癥的影響及其機制的研究　出處：《南昌大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:探討miR-146a對巨核細胞裂解產(chǎn)生的血小板免疫炎癥功能的影響及miR-146a對血小板免疫炎癥功能調(diào)控作用的機制。方法:(1)通過體外培養(yǎng)雙分化潛能的K562細胞,采用佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)誘導其向巨核細胞系分化,并最終可產(chǎn)生血小板;(2)通過向分化的巨核細胞內(nèi)分別導入miR-146a模擬物和阻遏物,轉(zhuǎn)染設(shè)置5個組,正常對照組:佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組;miR-146a mimic組:miR-146a模擬物導入佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組;miR-146a inhibitor組:miR-146a抑制物導入佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組;mimic-NC組:將mi R-146a模擬物陰性對照導入佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組;inhibitor-NC組:將miR-146a抑制物陰性對照導入佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組。(3)用q-RT-PCR檢測各組細胞中miR-146a表達水平的變化;用ELISA檢測血小板免疫炎癥分子IL-6、TNF-α分子水平;用RT-PCR檢測各組細胞中血小板免疫炎癥分子——NF-ΚB mRNA表達水平;用Western Blotting檢測各組細胞中血小板免疫炎癥分子——TLR4、NF-ΚB蛋白表達水平。(4)利用三種常用的靶基因預測軟件(TargetScan;PicTar;miRanda)預測miR-146a可能作用的靶基因,結(jié)合miR-146a在調(diào)控血小板免疫炎癥過程中的作用,在預測結(jié)果交集中篩選出IRAK1基因為潛在的靶基因;(5)通過熒光素酶報告基因法驗證IRAK1是否含有miR-146a的靶位點;(6)通過檢測過表達或抑制表達miR-146a后細胞中靶基因IRAK1 mRNA水平及蛋白水平的變化,從而確定miR-146a對靶基因IRAK1的影響。結(jié)果:(1)佛波酯成功誘導k562細胞分化為產(chǎn)血小板巨核細胞;(2)與miR-146a mimic陰性對照組相比,miR—146a mimic組miR—146a的表達顯著升高(約77.5倍),細胞上清液中IL-6、TNF-a顯著降低(p0.05);TLR4蛋白表達顯著升高(P0.05),NF-KB mRNA及NF-KB蛋白明顯降低(P0.05);與miR-146ainhibitor陰性對照組相比,miR-146a inhibitor組miR-146a表達下降(約7.5倍),細胞上清液中IL-6、TNF-a顯著升高(p0.05);TLR4蛋白表達顯著降低(P0.05),NF-KB mRNA及NF-KB蛋白明顯升高(P0.05);(3)生物信息軟件預測出IRAK1為hsa-mir-146a作用的靶基因;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,Pmir-Report-WT-IRAK1和miR-146a mimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶報告基因活性明顯受到抑制,而Pmir-Report-MUT-IRAK1和miR-146a mimic共轉(zhuǎn)染組、Pmir-Report-WT-IRAK1和mimic-NC共轉(zhuǎn)染組、Pmir-Report-MUT-IRAK1和mimic-NC共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶報告基因活性均無明顯變化;miR-146a過表達可抑制IRAK1蛋白表達水平,而對IRAK1 mRNA水平無影響。結(jié)論:(1)miR-146a調(diào)控血小板免疫炎癥分子IL-6、TNF-α的表達;(2)證實miR-146a可能是通過其靶基因IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)作用于TLR4/NF-ΚB信號通路,從而調(diào)控血小板免疫炎癥。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54;R743

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本文編號：1319171