發(fā)布時間：2017-12-18 23:09

  本文關(guān)鍵詞：DNA甲基化影響乙醛脫氫酶2（ALDH2）心肌缺血保護(hù)作用的基礎(chǔ)研究

  更多相關(guān)文章： DNA甲基化 MassARRAY 定量分析法 普通亞硫酸鹽測序法 低甲基化基因序列 乙醛脫氫酶2 DNA甲基化 心肌缺血 表觀遺傳學(xué)

【摘要】：乙醛脫氫酶2(ALDH2)是一種核編碼酶,主要作用是在線粒體基質(zhì)內(nèi)催化能量代謝過程中生成的醛類產(chǎn)物氧化,并生成對應(yīng)的有機(jī)酸。近幾年研究已證實ALDH2在心肌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),而且ALDH2在包括心肌缺血在內(nèi)的多種心肌損傷模型中均具有顯著的心肌保護(hù)作用。心肌缺血時,ALDH2催化毒性醛類4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)形成無毒的有機(jī)酸,從而阻斷4-HNE 相關(guān)的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)軸,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),阻斷下游由HSP70/JNK/p53介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡信號通路,最終發(fā)揮心肌缺血保護(hù)作用。另一方面,研究顯示在心肌缺血過程中,心肌ALDH2含量降低,而給予外源性ALDH2補(bǔ)充會減少心肌缺血損傷。但是,如何解釋“缺血心肌ALDH2表達(dá)降低”這一現(xiàn)象,研究者尚沒有滿意的研究證據(jù)。表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)指的是：在不改變DNA堿基序列的前提下,進(jìn)行的染色質(zhì)層面的修飾及調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方式包括組蛋白修飾、DNA甲基化及非編碼RNA干預(yù)(如micro RNA)。其中DNA甲基化(DNA methylation)可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平,其經(jīng)典作用位點為DNA序列中的胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)形成CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu),該位點DNA在甲基化處理后,其中的C形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。一般來說,基因啟動子區(qū)域高甲基化會降低其轉(zhuǎn)錄水平。而在心血管疾病領(lǐng)域,許多研究顯示DNA甲基化可以影響先天性心臟病、心肌病及冠心病等多種心血管疾病。我們已往研究證實了心肌缺血后microRNA34a曾多,而且nicroRNA34a與ALDH2的mRNA特異性結(jié)合可降低ALDH2翻譯水平。這一實驗結(jié)果為解釋心肌缺血過程中ALDH2減低提供了表觀遺傳學(xué)思路,但僅憑microRNA無法完全解釋該現(xiàn)象。因此,繼續(xù)探索影響ALDH2轉(zhuǎn)錄的相關(guān)機(jī)制或是解決這一問題的可行思路,而作為表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,DNA甲基化恰可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。因此,我們提出假設(shè)：在心肌缺血過程中,缺血缺氧刺激導(dǎo)致了ALDH2啟動子等基因調(diào)控序列的甲基化水平發(fā)生了變化,該DNA甲基化水平的變化進(jìn)一步導(dǎo)致了ALDH2轉(zhuǎn)錄水平降低。為了解釋這一問題,我們首先開展了有關(guān)ALDH2特異性低甲基化基因序列(LMR, low-methylated region)區(qū)域方法學(xué)研究,通過對比MassARRAY定量分析法與普通亞硫酸鹽法(BSP, Bisulfite sequencing PCR)兩者的檢測效果,為ALDH2特點基因序列選擇適宜的DNA甲基化檢測方法(第一部分)。在優(yōu)化DNA甲基化檢測方法的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步在Sprague Dawley大鼠上完成了心肌梗死模型以及后續(xù)藥物干預(yù)實驗。通過分析大鼠心梗邊緣心肌組織的ALDH2蛋白表達(dá)、mRNA表達(dá)及啟動子相關(guān)區(qū)域序列的甲基化水平,本研究擬探討導(dǎo)致缺血心肌ALDH2表達(dá)降低的DNA甲基化機(jī)制,并尋找發(fā)生甲基化異常的基因序列,為臨床心肌梗死診療提供新的思路及靶點(第二部分)。目的通過比較MassARRAY定量分析法與普通亞硫酸鹽測序法(BSP)在大鼠ALDH2基因啟動子甲基化檢測效果,為確定適用于低甲基化基因序列檢測的最佳方式提供依據(jù)。方法取10只體重為(200+10)g之間的雄性SD大鼠,分2組,每組5只,分為對照組與實驗組。實驗組行心臟冠脈左前降支結(jié)扎術(shù),制備心肌梗死模型。常規(guī)飼養(yǎng)7天后同時取材,實驗組取材部位為梗死邊緣區(qū)心肌組織,對照組取材位置與實驗組相同。提取邊緣區(qū)心肌組織DNA。分別使用MassARRAY定量分析法與普通BSP法檢測兩組ALDH2基因核心啟動子上游同一段DNA序列甲基化情況。結(jié)果BSP法可檢測顯示目標(biāo)區(qū)域12個CpG位點,檢測結(jié)果示對照組與實驗組皆無DNA甲基化發(fā)生；MassARRAY定量分析法可檢測目標(biāo)區(qū)域10個CpG位點,結(jié)果提示該DNA序列在對照組及實驗組均有有輕度DNA甲基化,且實驗組5號、6號及7號CpG位點的甲基化水平與對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論對于低甲基化基因序列,MassARRAY定量分析法擁有更好的DNA甲基化檢測精度,在定量分析DNA甲基化方面優(yōu)于BSP法。ALDH2基因啟動子相關(guān)序列中的部分特殊序列需采用MassARRAY檢測方式。目的通過比較MassARRAY定量分析法與普通亞硫酸鹽測序法(BSP)在大鼠ALDH2基因啟動子甲基化檢測效果,為確定適用于低甲基化基因序列檢測的最佳方式提供依據(jù)。方法取10只體重為(200+10)g之間的雄性SD大鼠,分2組,每組5只,分為對照組與實驗組。實驗組行心臟冠脈左前降支結(jié)扎術(shù),制備心肌梗死模型。常規(guī)飼養(yǎng)7天后同時取材,實驗組取材部位為梗死邊緣區(qū)心肌組織,對照組取材位置與實驗組相同。提取邊緣區(qū)心肌組織DNA。分別使用MassARRAY定量分析法與普通BSP法檢測兩組ALDH2基因核心啟動子上游同一段DNA序列甲基化情況。結(jié)果BSP法可檢測顯示目標(biāo)區(qū)域12個CpG位點,檢測結(jié)果示對照組與實驗組皆無DNA甲基化發(fā)生；MassARRAY定量分析法可檢測目標(biāo)區(qū)域10個CpG位點,結(jié)果提示該DNA序列在對照組及實驗組均有有輕度DNA甲基化,且實驗組5號、6號及7號CpG位點的甲基化水平與對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論對于低甲基化基因序列,MassARRAY定量分析法擁有更好的DNA甲基化檢測精度,在定量分析DNA甲基化方面優(yōu)于BSP法。ALDH2基因啟動子相關(guān)序列中的部分特殊序列需采用MassARRAY檢測方式。第一部分MassARRAY定量分析法與普通亞硫酸鹽測序法檢測乙醛脫氫酶2低甲基化基因序列效果的對比研究目的探索缺血缺氧條件下,心肌乙醛脫氫酶2(ALDH2)啟動子甲基化水平的變化,并從DNA甲基化這一角度解釋缺血心肌ALDH2水平降低。方法取40只體重為(200±10)g之間的雄性SD大鼠,分4組,每組10只,其中三組為心肌梗死模型組,造模方法為心臟冠脈左主干結(jié)扎術(shù),剩余一組為空白對照組。心肌梗死模型三組根據(jù)術(shù)后取材時間分為心梗一周組、心梗二周組及心梗三周組。取材部位為心肌梗死邊緣心肌組織,對照組仿心梗組位置取材。分別檢測取材心肌的ALDH2蛋白表達(dá)、DNA甲基化相關(guān)調(diào)節(jié)酶、mRNA表達(dá)、心肌DNA甲基化總體水平及ALDH2啟動子相關(guān)序列甲基化水平。另取10只雄性SD大鼠,注射地西他濱(DAC)干預(yù)體內(nèi)DNA甲基化,每天以1mg/kg標(biāo)準(zhǔn)給藥,一周后取材及檢測方法同前。結(jié)果與正常心肌組織相比,缺血邊緣區(qū)心肌ALDH2蛋白表達(dá)降低,mRNA表達(dá)降低(P0.05),但心肌DNA甲基化總體水平無顯著差異。與正常心肌組織相比,缺血邊緣區(qū)心肌ALDH2啟動子核心區(qū)域甲基化水平無差異,兩者均屬于未甲基化區(qū)域,該結(jié)果為BSP檢測所得。MassARRAY檢測顯示,缺血心肌ALDH2啟動子上游494bp序列存在多個甲基化異常位點(CpGl, CpG2及CpG7),其甲基化水平顯著高于正常心肌組織(P0.05)。給予DAC干預(yù)后該區(qū)域甲基化異常位點DNA甲基化水平降低,ALDH2蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)升高。結(jié)論心肌梗死造成缺血缺氧刺激導(dǎo)致ALDH2啟動子上游序列發(fā)生DNA甲基化水平升高,該表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致缺血心肌ALDH2轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平降低。DNA甲基化是調(diào)節(jié)缺血心肌ALDH2表達(dá)的重要機(jī)表觀遺傳學(xué)機(jī)制。目的探索缺血缺氧條件下,心肌乙醛脫氫酶2(ALDH2)啟動子甲基化水平的變化,并從DNA甲基化這一角度解釋缺血心肌ALDH2水平降低。方法取40只體重為(200±10)g之間的雄性SD大鼠,分4組,每組10只,其中三組為心肌梗死模型組,造模方法為心臟冠脈左主干結(jié)扎術(shù),剩余一組為空白對照組。心肌梗死模型三組根據(jù)術(shù)后取材時間分為心梗一周組、心梗二周組及心梗三周組。取材部位為心肌梗死邊緣心肌組織,對照組仿心梗組位置取材。分別檢測取材心肌的ALDH2蛋白表達(dá)、DNA甲基化相關(guān)調(diào)節(jié)酶、mRNA表達(dá)、心肌DNA甲基化總體水平及ALDH2啟動子相關(guān)序列甲基化水平。另取10只雄性SD大鼠,注射地西他濱(DAC)干預(yù)體內(nèi)DNA甲基化,每天以1mg/kg標(biāo)準(zhǔn)給藥,一周后取材及檢測方法同前。結(jié)果與正常心肌組織相比,缺血邊緣區(qū)心肌ALDH2蛋白表達(dá)降低,mRNA表達(dá)降低(P0.05),但心肌DNA甲基化總體水平無顯著差異。與正常心肌組織相比,缺血邊緣區(qū)心肌ALDH2啟動子核心區(qū)域甲基化水平無差異,兩者均屬于未甲基化區(qū)域,該結(jié)果為BSP檢測所得。MassARRAY檢測顯示,缺血心肌ALDH2啟動子上游494bp序列存在多個甲基化異常位點(CpGl, CpG2及CpG7),其甲基化水平顯著高于正常心肌組織(P0.05)。給予DAC干預(yù)后該區(qū)域甲基化異常位點DNA甲基化水平降低,ALDH2蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)升高。結(jié)論心肌梗死造成缺血缺氧刺激導(dǎo)致ALDH2啟動子上游序列發(fā)生DNA甲基化水平升高,該表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致缺血心肌ALDH2轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平降低。DNA甲基化是調(diào)節(jié)缺血心肌ALDH2表達(dá)的重要機(jī)表觀遺傳學(xué)機(jī)制。第二部分檢測缺血大鼠心肌細(xì)胞乙醛脫氫酶2啟動子甲基化水平變化的基礎(chǔ)研究
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 呂慧;閆惠琴;王岷;李永文;萬海粟;劉紅雨;吳蘅;周清華;;高低轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981和NL9980間甲基化差異基因的初步研究[J];中國肺癌雜志;2010年08期

2 譚寒星;黃利鳴;王艷林;;子宮頸癌病因?qū)W研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2010年17期

3 晁哲;鄭心力;孫瑞萍;魏立民;劉圈煒;劉海隆;黃麗麗;王峰;;豬Lbx2基因的克隆、序列分析及表達(dá)[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年08期

4 陳睿賾;張英杰;劉月琴;;DNA甲基化研究進(jìn)展及在羊育種中的應(yīng)用[J];中國草食動物科學(xué);2012年S1期

5 賈峰;杜錚;李亞男;謝世誠;孫博;劉衛(wèi)群;;河南寶豐氣象因子與烤煙DNA甲基化關(guān)系分析[J];氣象與環(huán)境科學(xué);2011年02期

6 ;Nasopharyngeal carcinoma:Advances in genomics and molecular genetics[J];Science China(Life Sciences);2011年10期

7 金鐵峰;張美花;林貞花;;腫瘤表觀遺傳學(xué)[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2011年02期

8 張林;劉輝;;DNA甲基化微陣列的非參數(shù)貝葉斯聚類算法[J];自動化學(xué)報;2012年10期

9 張明謙;劉文斌;陳洪強(qiáng);劉晉yN;;ANKRD18B基因在大腸癌中的甲基化與表達(dá)[J];昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2014年11期

10 戴勝冬;楊昆;;計算DNA序列模式特征的匹配算法[J];杭州電子科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 李慕軍;不同類型精子發(fā)生障礙全基因組甲基化差異分析與重要功能基因的表達(dá)驗證[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

2 賈峰;河南內(nèi)鄉(xiāng)與四川會理烤煙后期生長發(fā)育的分子特征研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 梁宇翔;CD147的表達(dá)與前列腺癌進(jìn)展的關(guān)系和CD147甲基化的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

4 沈谷群;宮頸鱗癌及其癌前病變高危因素、P450arom、ER-β及CYP1A1基因多態(tài)性的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2013年

5 趙洪良;燒傷后皮膚組織修復(fù)再生的基礎(chǔ)與臨床研究（汗腺再生及燒傷后化膿性肉芽腫診療）[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

，

本文編號：1305962