本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇通過上調(diào)SIRT1增加自噬流并促進(jìn)氧化低密度脂蛋白在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的降解

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【摘要】：目的:氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的自噬障礙參與了動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展。白藜蘆醇(RSV)對Ox-LDL引起的HUVECs損傷有保護(hù)作用。本研究旨在探討Ox-LDL引起HUVECs自噬障礙的具體機(jī)制,并探討RSV保護(hù)HUVECs的作用是否與其調(diào)控自噬流有關(guān)。方法:以HUVECs為研究動脈粥樣硬化的工具細(xì)胞;以O(shè)x-LDL及SIRT1激動劑RSV為工具藥;使用不同濃度及時間點(diǎn)的Ox-LDL及RSV處理HUVECs,采用CCK8檢測Ox-LDL及RSV對HUVECs活力的影響;采用western blot檢測HUVECs中SIRT1、LC3-II/LC3-I、p62的蛋白表達(dá)水平;采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測Ox-LDL對HUVECs內(nèi)p62的轉(zhuǎn)錄水平的影響;采用流式細(xì)胞儀及激光共聚焦方法檢測Dil-Ox-LDL在HUVECs中的聚集變化及RSV對HUVECs中Dil-Ox-LDL聚集的影響;采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建SIRT1基因敲減及GFP-RFP-LC3基因過表達(dá)細(xì)胞模型;采用激光共聚焦方法檢測細(xì)胞中自噬流的改變;采用western blot方法檢測溶酶體膜蛋白LAMP1及溶酶體酶cathepsin D蛋白表達(dá)水平;采用cathepsin D活性試劑盒檢測cathepsin D活性。結(jié)果:1.Ox-LDL能劑量(0、30、60、90、120μg/ml)、時間(0、0.5、1、3、6、12、24 h)依賴性增加HUVECs中LC3II、p62蛋白的表達(dá),減少SIRT1蛋白表達(dá);CCK8結(jié)果示Ox-LDL能劑量依賴性降低HUVECs活性(90μg/ml、120μg/ml有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);RT-PCR結(jié)果示Ox-LDL對HUVECs的p62轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響;在使用巴弗洛霉素(BAF-1)完全阻斷自噬流情況下,Ox-LDL不能增加LC3II的蛋白水平。2.0-50μM的RSV對HUVECs活性無損傷。RSV能劑量(0、12.5、25、50μM)及時間(0、0.5、1、3、6、12 h)依賴性增加HUVECs中SIRT1、LC3II并減少p62的蛋白水平,。3.50μM RSV能增加被Ox-LDL減少的SIRT1蛋白水平、減少被Ox-LDL增加的p62蛋白水平,并能進(jìn)一步增加LC3II的蛋白水平;激光共聚焦及流式細(xì)胞儀結(jié)果示RSV能顯著減少HUVECs內(nèi)Dil-Ox-LDL的聚集;但RSV并未減少HUVECs膜上被Ox-LDL誘導(dǎo)增加的植物凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)蛋白表達(dá)。4.激光共聚焦結(jié)果示Ox-LDL能增加轉(zhuǎn)染過GFP-RFP-LC3的HUVECs中的GFP-LC3、RFP-LC3的共定位,RSV能顯著減少HUVECs中被Ox-LDL引起的GFP-RFP-LC3共定位并進(jìn)一步增加RFP-LC3的點(diǎn)狀分布;Ox-LDL未改變HUVECs中溶酶體膜蛋白LAMP1的蛋白表達(dá);RSV能增加被Ox-LDL減少的HUVECs中溶酶體酶cathepsin D的成熟片段的蛋白表達(dá);cathepsin D活性試劑盒結(jié)果進(jìn)一步提示RSV能增加被Ox-LDL降低的HUVECs中cathepinsin D的活性;在使用巴弗洛霉素A1(抑制自噬體和溶酶體融合)后,RSV不能減少HUVECs中Dil-Ox-LDL的聚集。5.在敲減HUVECs中的SIRT1基因后,RSV對Ox-LDL引起的HUVECs中的SIRT1、LC3II、p62、cathepisin D蛋白水平改變的保護(hù)作用消失、同時不能增加被Ox-LDL降低的cathepsin D的酶活性,并且不能減少HUVECs中Dil-Ox-LDL的聚集。結(jié)論:白藜蘆醇通過上調(diào)HUVECs中SIRT1的表達(dá),可以增加溶酶體中cathepsin D的蛋白水平及cathepsin D酶活性而修復(fù)被Ox-LDL損傷的溶酶體功能,從而提高HUVECs中被Ox-LDL損傷的自噬流,進(jìn)一步促進(jìn)Ox-LDL在HUVECs中通過自噬溶酶體途徑的降解。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5

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