本文關(guān)鍵詞：氧化低密度脂蛋白對巨噬細(xì)胞作用機(jī)制的實驗研究

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【摘要】：目的:通過體外分離氧化低密度脂蛋白(oxidised low density lipoprotein,oxLDL)及體外誘導(dǎo)THP-1人單核細(xì)胞系分化形成單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞(monocytes derived macrophages,MDMs),結(jié)合細(xì)胞功能學(xué)實驗和免疫學(xué)實驗,探討ox LDL對巨噬細(xì)胞增殖的相關(guān)作用和分泌巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MMIF/MIF)的作用,并通過使用NF-κB通路抑制劑以及使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將shp65質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、敲低MDMs細(xì)胞內(nèi)的p65蛋白表達(dá),以此驗證NF-κB通路在MDMs分泌MIF過程中的作用。體內(nèi)實驗通過采集臨床上出現(xiàn)血管介入術(shù)后再狹窄患者的血清,以首次入院動脈粥樣硬化閉塞癥(artherosclerosis obliteran,ASO)患者及健康志愿者血清作為對照,分別檢測各組MIF水平,旨在觀察MIF在再狹窄患者體內(nèi)是否明顯升高,從而為之后進(jìn)一步研究MIF是否為介入術(shù)后再狹窄發(fā)生的風(fēng)險因素提供了理論基礎(chǔ)。方法:1.體外研究:(1)佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)成功誘導(dǎo)THP-1分化形成MDMs,經(jīng)油紅O染色證實為巨噬細(xì)胞后用于實驗。(2)兩步法超高速離心人血清,獲得密度為1.019-1.063g/ml的低密度脂蛋白,再經(jīng)紫外燈照射(254nm,0.5mW/cm2,2h)制備得到oxLDL,過濾消毒后用于實驗。(3)MDMs分別與25μg/m、50μg/ml和75μg/ml濃度oxLDL培養(yǎng)12h、24h及48h后,CCK-8法檢測細(xì)胞增殖,酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定各組上清的MIF濃度;以不加入oxLDL培養(yǎng)組為正常對照(normal control,NC)。(4)同法誘導(dǎo)含穩(wěn)轉(zhuǎn)NF-κB-Luc質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞分化形成NF-κB-Luc-MDMs,同上ox LDL濃度梯度培養(yǎng)后,熒光素酶底物(Luciferase)法通過化學(xué)發(fā)光儀檢測各組上清在加入底物后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度,以反映各組細(xì)胞NF-κB通路的激活情況。(5)在MDMs中分別加入終濃度為0和10μM的NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082,同法培養(yǎng)并檢測各組上清中的MIF濃度。(6)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shp65以敲低THP-1細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路活性,同法誘導(dǎo)后檢測各濃度梯度ox LDL對shp65-MDMs分泌MIF的影響。t檢驗進(jìn)行組間比較,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.再狹窄患者血清中MIF水平的檢測:(1)患者入選標(biāo)準(zhǔn)的制訂,采集無動脈粥樣硬化病變正常志愿者、首次入院ASO患者和ASO介入術(shù)后再狹窄動脈患者外周血。實驗組及對照組各組的患者血清樣本的采集及預(yù)處理。(2)ELISA檢測各組血清中的MIF濃度。(3)與各對照組MIF水平對比,統(tǒng)計分析各組外周血MIF水平差異。結(jié)果:1.體外研究:(1)與NC組相比,25μg/ml、50μg/ml及75μg/ml oxLDL組12h時MDMs增殖顯著升高,48h時分別達(dá)到17.7%、27.8%和41.2%(P0.001);其上清液MIF也在12h起升高,48h時分別是NC組的1.49、1.67和2.09倍(P0.001)。(2)與NC組相比,oxLDL各組在12h即可檢測到NF-κB通路明顯激活,24h時MDMs內(nèi)NF-κB通路活性分別增加38.1%、60.3%和61.1%(P0.001)。(3)加入BAY11-7082后,各組上清液MIF濃度在12h即出現(xiàn)明顯下降,48h時分別下降58.6%、69.3%、69.7%和73.5%(P0.001)。(4)shp65-MDMs的MIF分泌水平與對照組相比,各濃度組于12h即出現(xiàn)明顯下降,48h時分別下降42.6%、48.3%、40.7%和33.5%(P0.001)。2.再狹窄患者血清中MIF水平的檢測:相較于正常對照組,首次入院動脈粥樣硬化閉塞癥患者術(shù)前并無明顯MIF水平升高(p0.05),而發(fā)生介入術(shù)后再狹窄的患者入院時可見血清MIF水平的明顯升高(p0.05)。結(jié)論:(1)oxLDL可促進(jìn)MDMs的增殖能力。(2)oxLDL可促使MDMs合成分泌MIF,此過程涉及NF-κB信號通路,采用NF-κB抑制劑或敲低細(xì)胞內(nèi)p65蛋白表達(dá)可抑制MIF的分泌。(3)與正常人、未發(fā)生再狹窄患者血清MIF水平相比較,介入治療術(shù)后再狹窄患者的外周血MIF水平升高。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543

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