本文關(guān)鍵詞：熱休克蛋白65對T細(xì)胞中蛋白酪氨酸激酶Lck的活性及逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一個(gè)以血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血脂代謝異常為基礎(chǔ)、以血管慢性炎癥為特征的病理過程,可引發(fā)心肌梗死、腦梗死等嚴(yán)重危害人類健康和生命的疾病。近年來研究表明高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol, HDL)功能較血漿HDL-C水平更能準(zhǔn)確反映AS及冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),并且已有研究證實(shí)冠心病患者中HDL為失功能HDL,具有促AS作用。HDL是一個(gè)復(fù)雜的多功能蛋白復(fù)合體,可通過其促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport, RCT)、抗炎、抗氧化、抗血栓形成、增強(qiáng)內(nèi)皮功能、改善糖尿病的血糖控制情況以及抑制造血干細(xì)胞增殖等多種功能發(fā)揮抗AS作用。巨噬細(xì)胞膽固醇流出率可獨(dú)立于HDL-C水平更好地預(yù)測AS及冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),可作為評估HDL功能的一個(gè)金指標(biāo)。2014年發(fā)表在新英格蘭雜志的人群隊(duì)列研究中表明：膽固醇流出率作為代表逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的新的生物標(biāo)志物,與心血管事件發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。AS病灶內(nèi)存在著大量的免疫活性細(xì)胞—T淋巴細(xì)胞,這些免疫細(xì)胞激活后會釋放活性酶、細(xì)胞因子等,從而誘導(dǎo)血管壁炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),隨著AS進(jìn)展,T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞一樣增殖,在AS損傷及斑塊中的含量增加。熱休克蛋白65(heat shock protein65, HSP65)作為分枝桿菌主要抗原之一,具有很強(qiáng)的免疫原性,而且在感染機(jī)體時(shí)高度表達(dá),并被免疫系統(tǒng)識別。大量研究發(fā)現(xiàn),菌源HSP65含有多重T細(xì)胞表位,可以和自身HSP65發(fā)生交叉免疫反應(yīng),引發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。此外,AS斑塊中的T淋巴細(xì)胞也可以識別HSP65,并發(fā)生免疫反應(yīng),使輔助性T細(xì)胞功能失衡,而活化的T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞可分泌趨化因子聚集肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,也可決定B細(xì)胞和單核細(xì)胞的分化和功能,促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。淋巴細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, Lck)是一種在T細(xì)胞中表達(dá)的Src家族的細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶,在T細(xì)胞活化過程中起關(guān)鍵作用。T細(xì)胞活化之前,Lck首先通過N-末端的胱氨酸與CD4和CD8復(fù)合受體形成非共價(jià)鍵。T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的相互作用會導(dǎo)致Lck活化,隨之可引起磷脂酶Cγ1(phospholipase C, PLCγ1)的酪氨酸磷酸化而活化后,即可裂解胞膜的磷脂而產(chǎn)生1,4,5-三磷酸肌醇(insositol 1,4,5-trisphosphate, IP3)和1,2-二�；视�(diacylgycerol, DAG),進(jìn)一步通過IP3—Ca2+及DAG—蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)這兩個(gè)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié),經(jīng)核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)引起T細(xì)胞活化。其中,PKC激活及游離鈣升高在AS發(fā)生、發(fā)展過程中有及其重要的作用。另外,Lck還可激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activited protein kinases, MAPK)家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,通過其下游的AP-1、Fos、c-Jun分子發(fā)揮作用。有關(guān)HDL拮抗動脈粥樣硬化的機(jī)制,研究較多的是它的促膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、抗炎和抗氧化功能。另一方面,近些年來越來越多的資料證實(shí),免疫細(xì)胞可反過來直接影響HDL介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝。T細(xì)胞激活后可通過氧甾酮代謝酶、淋巴毒素、MAPK家族成員等通路抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),使細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)出率降低。因此,結(jié)合國內(nèi)外研究表明：免疫炎癥反應(yīng)可影響淋巴細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及膽固醇流出率；我們的前期研究也表明：HSP65介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可通過損害HDL功能及抑制膽固醇流出而促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。但HSP65是否對T細(xì)胞的脂質(zhì)代謝有影響,是否通過調(diào)控Lck及其下游信號通路而影響逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程還未得到證實(shí)。研究目的本研究在人T淋巴細(xì)胞(Jurkat細(xì)胞)水平評估不同劑量HSP65對細(xì)胞免疫活化及逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,同時(shí)運(yùn)用慢病毒shRNA-Lck基因沉默探索HSP65作用的下游基因及其功能表達(dá),明確HSP65影響T細(xì)胞逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的作用機(jī)制。研究方法1、不同濃度HSP65對細(xì)胞增殖能力、Lck蛋白活化及炎癥因子分泌的影響：實(shí)驗(yàn)分組：1)正常對照組,2)HSP65 0.25μg/ml組,3) HSP65 0.5μg/ml組,4) HSP65 0.75μg/ml組,5) HSP65 1μg/ml組；采用CCK-8檢測細(xì)胞在450nm處的吸光度,ELISA檢測細(xì)胞上清中細(xì)胞因于IFN-γ、IL-10的濃度,Western blot檢測酪氨酸激酶Lck蛋白表達(dá)情況。2、HSP65對細(xì)胞膽固醇流出率、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)的影響：實(shí)驗(yàn)分組：1)正常對照組,2) HSP65 0.25μg/ml組,3) HSP65 0.5μg/ml組,4) HSP65 0.75μg/ml組,5) HSP65 1μg/ml組；通過放射性同位素標(biāo)記法來檢測各組樣品的膽固醇流出率；提取細(xì)胞蛋白,Western blot檢測膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白表達(dá)情況；RT-PCR檢測五個(gè)膽固醇相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)子ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ、LXR-αmRNA表達(dá)水平。3、慢病毒shRNA-Lck轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后Lck在基因及蛋白水平的改變：實(shí)驗(yàn)分組：1)正常對照組(Jurkat),2)陰性對照組(NC),3) shRNA-Lck干擾組1(LV1),4) shRNA-Lck干擾組2(LV2)；將含有不同靶序列的基因片段以慢病毒為載體進(jìn)行包裝與滴度測定后干擾細(xì)胞。通過篩選出細(xì)胞最佳MOI(50)及感染條件：按照配制好的各組病毒稀釋液,加入各組孔中,200u1/孔；加入配制好的Polybrene稀釋液100u1/孔,使得孔內(nèi)終體積為1ml,Polybrene作用終濃度為5ug/ml;培養(yǎng)8h后,更換培養(yǎng)液,分別于轉(zhuǎn)染操作12h、24h、48h、72h后于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況,72h時(shí)使用流式細(xì)胞儀測GFP熒光細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。之后,收集各組細(xì)胞,通過real time-PCR和Western blot檢測酪氨酸激酶Lck在基因及蛋白水平的表達(dá)情況。4、慢病毒shRNA-Lck轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞對Lck下游信號通路及逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響：實(shí)驗(yàn)分組：1)正常對照組(Jurkat),2)陰性對照組(NC),3) shRNA-Lck干擾組1(LV1),4) shRNA-Lck干擾組2(LV2)；通過Fluo-3/AM激光共聚焦掃描法檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度；[3H]放射性同位素標(biāo)記檢測各組樣品的膽固醇流出率；油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴含量；高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量。5、慢病毒shRNA-Lck轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞對Lck下游信號通路蛋白及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響：實(shí)驗(yàn)分組：1)正常對照組(Jurkat),2)陰性對照組(NC,3) shRNA-Lck干擾組1(LV1),4) shRNA-Lck干擾組2(LV2)；通過Western blot檢測Lck下游通路蛋白ERK1/2、JNK通路磷酸化,PKC-γ及NF-κB蛋白水平；檢測膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ和LXR-α表達(dá)情況。6、shRNA-Lck轉(zhuǎn)染對1μg/ml HSP65誘導(dǎo)下Jurkat細(xì)胞的Lck下游信號通路及逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響：實(shí)驗(yàn)分組：1)1μg/ml HSP65組,2)NC+1μg/ml HSP65組,3)LV1+1μg/ml HSP65組,4) LV2+1μg/ml HSP65組；通過Fluo-3/AM激光共聚焦掃描檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,Western blot檢測Lck下游通路蛋白表達(dá)情況(ERK1/2、JNK蛋白磷酸化,PKC-γ及NF-κB蛋白表達(dá)水平)；[3H]放射性同位素標(biāo)記檢測各組樣品的膽固醇流出率；Western blot檢測脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白表達(dá)情況；油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴含量；高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量。7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,并采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩樣本均數(shù)比較的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,多組間總體均數(shù)比較,在方差齊時(shí)采用單向方差分析(one-way ANOVA),方差不齊時(shí)采用Welch校正檢驗(yàn)。多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較方差齊時(shí)采用LSD法檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1、HSP65可促進(jìn)Jurkat細(xì)胞增殖,活化Lck蛋白表達(dá),使IFN-γ分泌增加、IL-10分泌減少,在本實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性用不同濃度HSP65 (0、0.25、0.5、0.75、1μg/ml)刺激Jurkat細(xì)胞后,各組之間整體比較,不同組間細(xì)胞增殖能力呈顯著性差異(F=90.513,P0.001)。與正常對照組相比,0.25μg/ml組、0.5μg/ml HSP65組、0.75μg/ml HSP65組和1μg/ml HSP65組在450nm處的吸光度均明顯升高(P0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同組間Lck蛋白表達(dá)量隨HSP65濃度梯度增高逐漸增強(qiáng)。與正常對照組(0.89±0.22)比較,0.75μg/ml HSP65組Lck蛋白表達(dá)量(1.69±0.16)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),1μg/ml HSP65組Lck蛋白表達(dá)量(1.90±0.83)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。不同濃度HSP65可以使促炎因子IFN-γ分泌增加,抑炎因子IL-10分泌減少。不同濃度HSP65對Jurkat細(xì)胞上清中IFN-γ的分泌作用與正常對照組(15.59±0.86)相比均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。與0.25μg/ml組(17.58±0.89)相比,0.5μg/ml HSP65組(18.76±1.08)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；與0.75μg/ml組相比,1μg/ml組(25.02±0.98)升高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。與正常對照組(21.86±0.92)相比,隨著藥物濃度的升高,HSP65對細(xì)胞上清中IL-10的作用逐漸減弱,結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與0.25μg/ml組(19.89±1.249)相比,0.5μg/ml HSP65組(17.07±1.28)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)。通過此實(shí)驗(yàn)證明HSP65能活化增殖T細(xì)胞,促使T細(xì)胞分化(Th1/Th2)功能失衡,具有致AS作用。2、HSP65可抑制膽固醇流出率,下調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)調(diào)節(jié)子(ABCA1、ABCG1、 SR-BI、PPAR-γ、LXR-α)蛋白及mRNA的表達(dá)將不同濃度的HSP65 (0、0.25、0.5、0.75、1μg/ml)刺激Jurkat細(xì)胞后,與正常對照組(21.27±2.44%)相比,不同HSP65濃度刺激組膽固醇流出率明顯降低(膽固醇流出率分別為15.56±2.58%,14.36±1.42%,12.96±2.45%和10.69±2.03%)(P0.001),且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)成劑量依賴性,具有顯著性差異。與正常對照組比較,此實(shí)驗(yàn)中HSP65刺激效應(yīng)在1μg/ml濃度時(shí)膽固醇流出率降低最為明顯,故此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用1μg/ml濃度進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)HSP65對膽固醇轉(zhuǎn)出功率的影響,因此在本實(shí)驗(yàn)中我們著重觀察HSP65對膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制：給予不同濃度HSP65處理細(xì)胞后,ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ和LXR-α五個(gè)蛋白各自組間差異顯著(F=15.615,P0.001；F=18.069,P0.001；F=5.212,P0.05；F=8.426,P0.05；F=40.369,P0.001)。與正常對照組比較,HSP65可明顯下調(diào)了ABCA1、 ABCG1、SR-BI、PPAR-γ及LXR-α五個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平,且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴效應(yīng),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與正常對照組比較,0.25μg/ml HSP65組ABCG1、PPAR-γ和LXR-α mRNA表達(dá)量均明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而0.25μg/ml HSP65組ABCA1和SR-BI mRNA表達(dá)量與對照組相比較無明顯差異(P0.05),差異無統(tǒng)計(jì)意義；與正常對照組比較,0.5μg/ml HSP65組ABCA1,ABCG1,SR-B1,PPAR-γ和LXR-α mRNA表達(dá)量均明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)意義。通過此實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了在此濃度范圍內(nèi)的HSP65能明顯降低免疫細(xì)胞的膽固醇流出率,下調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及基因表達(dá),但具體是通過哪些信號通路介導(dǎo),是否與免疫活化反應(yīng)有關(guān),還需要進(jìn)一步證實(shí)。3、慢病毒shRNA-Lck可明顯沉默細(xì)胞的Lck基因表達(dá),下調(diào)Lck蛋白表達(dá)上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSP65作用于Jurkat細(xì)胞后,酪氨酸激酶Lck的蛋白表達(dá)量會隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng),說明HSP65刺激細(xì)胞能活化Lck,因此在本實(shí)驗(yàn)中,我們構(gòu)建了兩個(gè)不同靶序列基因片段,以慢病毒為載體(shRNA)來沉默Lck基因表達(dá),旨在研究Lck是否介導(dǎo)HSP65引起的逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能改變及其作用機(jī)制。與陰性對照組比較,LV1組與LV2組Lck蛋白表達(dá)均降低(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與上述結(jié)果相似,與陰性對照組比較,LV1組與LV2組Lck mRNA表達(dá)量均明顯降低(P0.001),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、慢病毒shRNA-Lck既可抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量,又可促進(jìn)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程與陰性對照組相比,LV1組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(99.91±7.75,P0.001)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LV2組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(108.15±11.75,P0.001)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了明確Lck是否參與免疫細(xì)胞的逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程,我們對采用shRNA-Lck基因沉默后的細(xì)胞檢測膽固醇轉(zhuǎn)出率。與陰性對照組(19.08±0.63%)比較,LV1組膽固醇流出率明顯升高(23.46-±1.53%,P0.001),LV2組膽固醇流出率明顯升高(25.27±2.01%,P0.001),均具有顯著性差異。作為評價(jià)細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)出率的間接指標(biāo),我們檢測了細(xì)胞內(nèi)脂滴及膽固醇酯含量。通過油紅O染色測定細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴含量,經(jīng)Image J軟件相對定量(總脂滴含量/細(xì)胞體積)后結(jié)果：與陰性對照組(0.15±0.01%)比較,LV1組細(xì)胞內(nèi)脂滴含量(0.09±0.02%,P0.05),差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LV2組細(xì)胞內(nèi)脂滴含量明顯降低(0.07±0.05%,P0.05),具有顯著性差異。通過高效液相色譜法測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量/細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量,結(jié)果顯示：與陰性對照組(0.50±0.02)相比,LV1組(0.30±0.04)與LV2組(0.32±0.02)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯相對含量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：Lck在T細(xì)胞逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用。5、shRNA-Lck可下調(diào)Lck下游通路蛋白的表達(dá),上調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)上一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)Lck對細(xì)胞免疫通路及逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通路均存在影響,因此在本實(shí)驗(yàn)中我們著重觀察Lck具體是通過下游哪些通路蛋白對膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)。我們分別將兩段帶有Lck干擾片段的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞72h后,分別提取各組蛋白,檢測DAG下游蛋白PKC-γ表達(dá),MAPK家族成員ERK1/2、JNK磷酸化水平,及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性。結(jié)果顯示：兩個(gè)靶序列的RNA干擾片段均明顯下調(diào)了ERK1/2、JNK、PKC-γ和NF-κB四個(gè)蛋白的表達(dá)水平。與陰性對照組相比,LV1組與LV2組PKC-γ蛋白表達(dá)含量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；ERK1/2和.JNK磷酸化水平、NF-κB三個(gè)蛋白各自組間差異顯著(F=24.248,P0.001；F=69.837,P0.001；F=20.62,P0.001)。與陰性對照組比較,LV1組ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05),均具有顯著性差異,而SR-BI、PPAR-γ和LXR-α組間比較無明顯差異(P0.05)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LV2組ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ和LXR-α蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05),具有顯著性差異。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果及國外研究提示：Lck可能通過下游ERK1/2、JNK、NF-κB等信號蛋白通路,抑制膽固醇相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,從而下調(diào)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能。6、HSP65通過Lck及其下游信號蛋白發(fā)揮抑制逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能為了進(jìn)一步觀察上一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論的Lck及其下游信號通路是否參與HSP65促進(jìn)細(xì)胞免疫活化的效應(yīng),我們在Lck基因沉默后,給予1μg/ml HSP65刺激24小時(shí)。與NC+1μg/ml HSP65組(240.47±13.63)相比,LV1+1μg/ml HSP65組(128.86±10.26)與LV2+1μg/ml HSP65組(127.20±13.19)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。與NC+1μg/ml HSP65組相比,LV1+1μg/ml HSP65組與LV2+1μg/ml HSP65組PKC-γ蛋白表達(dá)含量、ERK1/2和JNK磷酸化水平及NF-κB四個(gè)蛋白各自組間差異顯著(P0.05；P0.05；P0.001；P0.001)。以上研究表明：HSP65介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫活化反應(yīng)是由Lck及其下游信號通路介導(dǎo)。為進(jìn)一步觀察Lck及其下游信號通路是否參與HSP65抑制細(xì)胞中逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的效應(yīng),我們在Lck基因沉默后,給予1μg/ml HSP65刺激24小時(shí)。與NC+1μg/ml HSP65組(10.83±1.23%)比較,LV1+1μg/ml HSP65組(17.89±2.39%)及LV2+1μg/ml HSP65組(17.76±1.33%)膽固醇流出率均明顯升高(P0.001),具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過油紅O染色測細(xì)胞內(nèi)脂滴含量,發(fā)現(xiàn)：與NC+1μg/ml HSP65組(0.22±0.04%)比較,LV1+1μg/ml HSP65組(0.11±0.05%)細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LV2+1μg/ml HSP65組(0.12±0.04%)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量降低,具有顯著性差異(P0.05)。通過高效液相色譜法測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量/細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量,結(jié)果顯示：與NC+1μg/ml HSP65組(0.66±0.01)相比,LV1+1μg/ml HSP65組(0.40±0.03)與LV2+1μg/ml HSP65組(0.41±0.01)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯相對含量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與NC+1μg/ml HSP65組比較,LV1+1μg/ml HSP65組ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ和LXR-α蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LV2+1μg/ml HSP65組ABCA1和SR-BI蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05),具有顯著性差異,而ABCG1、PPAR-γ和LXR-α組間比較未見明顯變化,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HSP65能抑制RCT,Lck活性在此過程中起著重要作用。結(jié)論1.HSP65在濃度范圍內(nèi)(0-1μg/ml)可誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖,活化蛋白酪氨酸激酶Lck,誘導(dǎo)促炎因子IFN-γ分泌,抑制抗炎因子IL-10分泌。2.HSP65誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)的同時(shí)損害了HDL的逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能,可降低T細(xì)胞膽固醇流出率,下調(diào)細(xì)胞ABCA1,ABCG1,SR-B1,PPAR-γ和LXR-α的表達(dá),且隨著HSP65劑量的增加,對逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響愈加明顯。3.構(gòu)建的兩段不同的Lck基因靶序列均能成功地在受感染細(xì)胞中表達(dá),并能特異且高效抑制Lck蛋白的表達(dá),從而下調(diào)其下游相關(guān)信號分子的表達(dá)。4.RNAi技術(shù)阻斷Lck活化后,能增強(qiáng)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白水平,提高細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率,進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量。5.HSP65通過活化Lck既能促進(jìn)TCR介導(dǎo)的免疫信號通路,又能抑制T細(xì)胞的逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程。6.通過本研究及以前資料我們得出總結(jié)論：HSP65通過Lck及其下游免疫信號通路抑制T細(xì)胞的逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5

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本文編號：1213188