本文關(guān)鍵詞：血清淀粉樣P物質(zhì)對巨噬細胞炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激的影響及機制

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【摘要】：第一部分血清淀粉樣P物質(zhì)對巨噬細胞炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激的影響及機制研究背景動脈粥樣硬化性心血管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)是當(dāng)今世界發(fā)病率乃至死亡率最高的疾病之一。動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)則是ASCVD最基本的的病理生理學(xué)基礎(chǔ),動脈粥樣硬化的具體發(fā)生機制,現(xiàn)仍未完全明確,目前最公認的主要是血栓形成學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說和炎癥學(xué)說等,無論是脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等都是AS形成的主要的病理特征,也是促進AS發(fā)生發(fā)展的重要因素。血脂代謝異常是其重要的危險因素之一,體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的增加,產(chǎn)生大量的活性氧、活性氮離子,促進低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)的氧化修飾,形成的氧化低密度脂蛋白(oxdized low-density lipoprotein, Ox-LDL)極易損傷內(nèi)皮功能、促進膽固醇的內(nèi)皮下沉積和激活巨噬細胞遷移與吞噬,最終形成泡沫細胞并激活進一步的炎癥反應(yīng),加速AS的演變。多項研究證明,炎癥、免疫反應(yīng)參與了動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展的各個階段,白介素(interleukins, IL)、干擾素(interferons, IFN)、腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor, TNF)等炎癥因子在粥樣斑塊中有表達,而且?guī)缀跛信c動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展相關(guān)的細胞均可以分泌細胞因子,并且對相應(yīng)的細胞因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答,這也是炎癥、免疫反應(yīng)成為影響AS進程的重要因素之一,也是防治AS的重要靶點之一。血清淀粉樣P (Serum amyloid P, SAP)物質(zhì)與C反應(yīng)蛋白(C reactive protein,CRP)和正五聚蛋白3(pentraxin 3, PTX3)同屬正五聚體家族,它們與炎癥免疫反應(yīng)有著不可分割的聯(lián)系。最初SAP是作為一種淀粉樣沉積蛋白為人們所認識,認為其在系統(tǒng)性淀粉樣變性疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用,后來,研究逐漸發(fā)現(xiàn)SAP參著與體內(nèi)的固有免疫、炎癥反應(yīng)、淀粉樣變等多種活動,近年來SAP在心血管方面的作用也漸漸為人們所認識。研究發(fā)現(xiàn),冠心病患者血液中SAP的濃度要明顯高于正常人,在不穩(wěn)定性心絞痛的患者中尤為顯著,但是其在心血管疾病中的具體病理生理作用卻并不十分明確。研究目的通過不同濃度的SAP作用RAW264.7細胞,觀察SAP對RAW264.7分泌炎癥因子、產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物等的影響,并且觀察其對炎癥相關(guān)的機制蛋白的影響,探尋SAP對炎癥免疫反應(yīng)作用的可能機制。研究方法1.細胞培養(yǎng)與實驗分組：細胞接種于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基,在每次實驗前將巨噬細胞密度調(diào)整為1×10+個／孔,加入6孔板中,無血清培養(yǎng)基饑餓24h后,對照組不予以處理,SAP組加入不同濃度SAP刺激24h后,收取樣本檢測。實驗分為4組：1)空白對照組,2)SAP 1.25ug/ml組,3)SAP 2.5ug/ml組,4)SAP 5ug/ml組2.不同濃度的SAP對RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響用不同濃度的SAP作用RAW264.7細胞24h后,收集細胞上清,用ELISA檢測細胞上清炎癥因子白介素1-β(interleukin-1β)、腫瘤壞死因子-a(Tumor Necrosis Factor-a, TNF-a)以及氧化應(yīng)激指標(biāo)一氧化氮(Nitric Oxide, NO)的分泌,用流式細胞術(shù)檢測細胞表面細胞間黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)及炎癥相關(guān)Fcy受體的表達,并用RT-PCR復(fù)測IL-1β、 TNF-a及ICAM-1 mRNA的表達。3.不同濃度的SAP對炎癥相關(guān)機制蛋白的影響用不同濃度的SAP作用RAW264.7細胞24h后,RIPA裂解液裂解細胞提取蛋白,用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測Fcγ受體通路下游蛋白脾酪氨酸蛋白激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)的表達,以及炎癥相關(guān)的MAPK家族蛋白細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK 1/2)、磷酸化ERK1/2 (pERK)的表達。4.統(tǒng)計學(xué)處理所有計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,并采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行兩樣本均數(shù)比較的獨立樣本t檢驗分析,多組間總體均數(shù)比較,在方差齊時采用單向方差分析(one-way ANO VA),方差不齊時采用Welch校正檢驗。多個樣本均數(shù)間的多重比較方差齊時采用LSD法檢驗,方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果1.不同濃度的SAP對細胞上清中IL-1β、TNF-α、 ICAM-1及活性氮NO的分泌的影響結(jié)果顯示,SAP可促進炎癥因子IL-1β、 TNF-α、ICAM-1以及活性氮NO的分泌,且這種作用有一定的濃度依賴性。與空白對照組相比,SAP三組中IL-1β的表達量均明顯升高,2.5ug/ml及5ug/ml組的fNF-a相較對照組與1.25ug/ml組均有明顯升高趨勢,5ug/ml組的ICAM-1和NO分泌相較于對照組和1.25ug/ml組均明顯升高,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義,其余幾組之間并無統(tǒng)計學(xué)差異,但是仍有隨濃度升高分泌增加的趨勢。2.不同濃度SAP對炎癥因子IL-1β、TNF-α、ICAM-1 mRNA表達的影響結(jié)果顯示,與空白對照組相比,加入SAP刺激之后,三種炎癥因子的nRNA表達量均有明顯增高,且有一定的濃度依賴性。5ug/ml組的三種炎癥因子分泌與其他三組之間均有明顯升高趨勢,2.5ug/ml組的IL-1β、TNF-α的mRNA表達相較于空白對照組和1.25ug/ml組均有升高,結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義,其余幾組之間并無統(tǒng)計學(xué)差異,但是仍有隨濃度升高分泌增加的趨勢。3.不同濃度的SAP對炎癥相關(guān)機制蛋白的影響SAP刺激后Syk明顯增加,相較于空白對照組,1.25ug/ml、2.5ug/ml、 5ug/ml組Syk表達量明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,且2.5ug/ml組與5ug/ml組相較1.25ug/ml組Syk表達量亦有升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。而SAP作用后Fcγ受體、pERK 1/2的表達并無明顯改變,和空白對照組相比并無統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)論本研究通過觀察不同濃度SAP對炎癥免疫以及氧化應(yīng)激的作用,發(fā)現(xiàn)SAP與Fcγ受體結(jié)合后,不改變Fcy受體的表達,通過增加Syk的表達,增加炎癥因子IL-1β、TNF-α以及黏附分子ICAM-1的分泌,促進活性氮NO的生成,由此可見,在動脈粥樣硬化的進程中,SAP可促進炎癥免疫、氧化應(yīng)激反應(yīng),在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用,但具體調(diào)節(jié)機制仍需要更進一步的研究證明。第二部分普羅布考對冠心病病人PCI術(shù)后再狹窄影響的系統(tǒng)回顧和meta分析研究背景冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease, CHD)一直是當(dāng)今世界發(fā)病率乃至死亡率最高的疾病之一,作為人類的頭號殺手,冠心病的預(yù)防與治療一直是困擾著我們的重大難題。近些年經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)已經(jīng)逐漸成為冠心病尤其是有冠狀動脈嚴重狹窄病人的首選內(nèi)科治療方案,無論是球囊擴張術(shù)還是支架置入術(shù)都可以在短時間內(nèi)開放狹窄血管、恢復(fù)心臟供血、減少心肌細胞壞死,對病人癥狀的緩解和預(yù)后都有較大的獲益。然而,有一個問題嚴重影響了PCI的遠期治療效果,那就是PCI術(shù)后的血管內(nèi)再狹窄,不管是血管形成術(shù)(30%-50%)還是支架內(nèi)置入(15%-20%)都有較高的血管內(nèi)再狹窄率,而如何減少再狹窄率則是亟待解決的臨床問題。普羅布考是一個歷史悠久的調(diào)脂藥物,能夠明顯降低總膽固醇(total和低密度脂蛋白膽固醇cholesterol, TC)且對家族性高膽固醇血癥(FH)患者的黃色瘤有獨特的降解作用,(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C),而普羅布考最開始卻作為一種工業(yè)抗氧劑而為人們所認識,有著強烈的抗氧化作用,能夠保護正常細胞不受氧化應(yīng)激損傷,氧化應(yīng)激損傷也是發(fā)生PCI術(shù)后再狹窄的一大原因之一,對于普羅布考對PCI再狹窄的作用也有多項研究來探討驗證,但是多項研究的結(jié)果卻不盡一致,因此,本部分研究致在探討普羅布考PCI術(shù)后血管內(nèi)再狹窄的具體作用以及可能的機制。研究方法兩名研究者通過在線檢索和PubMed, EMBASE, ScienceDirect圖Cochrane書館等數(shù)據(jù)庫,并且手工檢索會議、書籍論文和相關(guān)論文的參考文獻等,通過摘要初篩出與普羅布考及冠心病、PCI術(shù)后再狹窄等相關(guān)的隨機對照研究,再通過仔細閱讀全文,確定納入文獻,分組：實驗組為規(guī)律服用普羅布考并行PCI的冠心病患者,對照組則為除了常規(guī)藥物治療,未服用任何調(diào)脂藥的行PCI的冠心病患者,隨訪期大于3個月,并在隨訪結(jié)束時再次行冠狀動脈造影檢查,檢查球囊擴張或支架置入處管腔狹窄程度,綜合兩次造影結(jié)果,評價兩組間管腔再狹窄率、最小管腔內(nèi)徑晚期丟失(minimal luminal diameter, MLD)、和隨訪期間主要心血管事件(late loss)發(fā)生率,(major adverse cardiac events, MACEs)并結(jié)合亞組分析、敏感性分析、漏斗圖等評價結(jié)果穩(wěn)定性和有無選擇偏倚等,用RevMan 5.2進行文獻質(zhì)量評價以及結(jié)果分析。研究結(jié)果1.在線和手動檢索了327篇文獻,初篩后有37篇相關(guān)文章,仔細閱讀全文后,納入10篇隨機對照研究,共859人；2.數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),對于主要指標(biāo)再狹窄率來說,無論是病人再狹窄率(RR=0.52[0.40,0.68],P0.00001)還是血管內(nèi)再狹窄率((RR=0.59[0.43,0.80],P=0.0007),普羅布考組相較于對照組,再狹窄率均明顯減少,而次要指標(biāo)中,普羅布考組的MLD較對照組有明顯增加(SMD= 0.45 [0.30,0.61], P＜0.00001),晚期丟失則有所下降(SMD=-0.41 [-0.60,-0.22], P＜0.0001),而臨床上最關(guān)心的指標(biāo)MACEs,普羅布考組的MACEs發(fā)生率較對照組明顯下降(RR=0.69[0.51,0.93],P=0.01)；3.異質(zhì)性分析發(fā)現(xiàn),指標(biāo)MLD的異質(zhì)性略高(P=0.01,I2=42%),亞組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),行血管形成術(shù)和支架置入術(shù)患者MLD有一定差異(P=0.05),這可能是MLD異質(zhì)性的來源；4.敏感性分析可證實驗結(jié)果較為穩(wěn)定,漏斗圖發(fā)現(xiàn)納入文獻并無發(fā)表偏倚。研究結(jié)論：普羅布考能夠明顯降低冠心病病人PCI術(shù)后患者血管再狹窄率和晚期血管丟失,增加血管最小管腔內(nèi)徑,并且可以減少臨床主要心血管事件的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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