本文關(guān)鍵詞：硝酸甘油對(duì)冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外增殖的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：目的：內(nèi)皮功能障礙尤其是內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)功能障礙參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)外周血一氧化氮(nitric oxide, NO)濃度與循環(huán)EPCs水平呈明顯正相關(guān),提示NO與循環(huán)EPCs功能具有密切的聯(lián)系。鑒于硝酸甘油能通過(guò)提供外源性NO來(lái)模擬內(nèi)源性NO釋放系統(tǒng)的作用以及NO與EPCs增殖的密切關(guān)系,硝酸甘油極有可能促進(jìn)冠心病患者EPCs的增殖,擁有擴(kuò)血管作用之外的心血管保護(hù)作用,盡管有硝酸甘油過(guò)量耐藥引起EPCs增殖和功能障礙的報(bào)道,但硝酸甘油在臨床常用的非耐藥情況下對(duì)EPCs增殖的影響無(wú)疑也具有重要的臨床意義,對(duì)此目前缺乏系統(tǒng)的研究。此外,硝酸甘油非中毒濃度范圍內(nèi)對(duì)EPCs增殖的影響機(jī)制、過(guò)量耐藥產(chǎn)生的機(jī)制和對(duì)抗耐藥的方法等問(wèn)題,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有系統(tǒng)的研究報(bào)道。本研究體外培養(yǎng)冠心病患者外周血EPCs,觀察不同濃度硝酸甘油刺激后,冠心病患者外周血EPCs體外增殖的變化,探索硝酸甘油對(duì)EPCs體外增殖的影響及其與藥物濃度的關(guān)系,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),探討硝酸甘油在典型藥物濃度時(shí)對(duì)EPCs體外增殖影響的相關(guān)分子機(jī)制以及硝酸甘油耐藥的干預(yù)措施,以期為硝酸甘油在冠心病治療中的使用提供新的基礎(chǔ)理論依據(jù),探討其在適宜濃度下成為促EPCs增殖藥物的可行性,并為解決硝酸甘油耐藥問(wèn)題提供新的思路。方法：1.取正常健康志愿者的外周血20m1/例,用密度梯度離心法從外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞,并將其接種在人纖維連接蛋白包被的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,用加入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、鏈霉素、青霉素及胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,7天后收集貼壁細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察及DiI標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行雙熒光染色鑒定,雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞為正在分化的EPCs,并將貼壁細(xì)胞重新接種后用MTT法描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。2.經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影等資料確診為冠心病的患者60例,取外周血20m1/例,培養(yǎng)7天后收集貼壁細(xì)胞重新接種,選擇采用不同濃度的硝酸甘油0.0 mg/L(對(duì)照組)、0.3mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、7.5mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L,對(duì)冠心病患者EPCs體外培養(yǎng)進(jìn)行干預(yù),并用MTT法及人工計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO、人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A和過(guò)氧化亞硝基陰離子的產(chǎn)生水平,觀察硝酸甘油對(duì)冠心病患者外周血EPCs的增殖能力的影響。3.觀察在硝酸甘油典型藥物濃度7.5mg/L及20.0mg/L的基礎(chǔ)上聯(lián)用磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositide-3-kinase,PI3K)抑制劑LY294002(在硝酸甘油干預(yù)前12小時(shí)用LY294002提前干預(yù))對(duì)冠心病患者外周血EPCs體外增殖的影響,并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO、人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A和貼壁細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生水平,并用Western blotting檢測(cè)貼壁細(xì)胞的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonone protein kinase,Akt) (Ser473)、磷酸化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(phospho-serine-threonone protein kinase,P-Akt) (Ser473)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthetase,eNOS) (Ser1177)和磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(phospho-endothelial nitric oxide synthetase,P-eNOS) (Ser1177)的表達(dá),以初步探索硝酸甘油影響EPCs增殖的機(jī)制。4.在硝酸甘油中毒濃度20.0mg/L基礎(chǔ)上聯(lián)用p-巰基乙醇(在硝酸甘油干預(yù)前4小時(shí)先用p-巰基乙醇干預(yù)),復(fù)測(cè)EPCs增殖能力,活性氧的產(chǎn)生及貼壁細(xì)胞Akt (Ser473)、P-Akt (Ser473)、eNOS (Ser1177)和P-eNOS (Ser1177)的表達(dá),探討β-巰基乙醇對(duì)硝酸甘油耐藥的影響及其潛在機(jī)制。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用單因素方差分析比較組間差異,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.倒置相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征：培養(yǎng)24小時(shí)后單個(gè)核細(xì)胞開(kāi)始貼壁,培養(yǎng)7天的EPCs,可見(jiàn)細(xì)胞克隆周圍出現(xiàn)梭形細(xì)胞(圖1A)；培養(yǎng)14天的EPCs,可見(jiàn)呈大的集落樣生長(zhǎng),四周梭形細(xì)胞放射狀排列(圖1B)；再多培養(yǎng)1-2天呈鋪路石樣改變(圖1C)。用DiI標(biāo)記的乙�；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素鑒定EPCs吸附FITC標(biāo)記的荊豆凝集素呈綠色(×100)(圖1D),EPCs吸附DiI標(biāo)記的乙�；兔芏戎鞍壮始t色(×100)(圖1E),同時(shí)吸附二者呈黃色(x100)(圖1F)；外周血EPCs的生長(zhǎng)曲線：將分離得到的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7天后,將貼壁細(xì)胞按2×105/ml重懸接種在96孔板中,用MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。可見(jiàn)細(xì)胞增殖開(kāi)始有明顯的上升趨勢(shì),從第1天到第5天(相當(dāng)于第8-12天)細(xì)胞的吸光度值表現(xiàn)為逐漸增加趨勢(shì),尤其到第7天(相當(dāng)于第14天)的EPCs增殖能力明顯增強(qiáng)(圖2)。2.本研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油在7.5 mg/L促外周血EPCs增殖達(dá)峰值,但增加硝酸甘油濃度至20.0mg/L出現(xiàn)明顯抑制增殖效應(yīng)(圖3)；培養(yǎng)上清液NO含量隨硝酸甘油濃度增加呈現(xiàn)濃度梯度現(xiàn)象(圖4)；上清液過(guò)氧化亞硝基陰離子含量及貼壁細(xì)胞活性氧在硝酸甘油濃度7.5mg/L的范圍內(nèi)增加不明顯,濃度20.0mg/L時(shí)明顯高于對(duì)照組(圖4和圖5)；上清液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A含量在硝酸甘油濃度7.5 mg/L時(shí)達(dá)峰值,之后下降(圖4A)；7.5 mg/L硝酸甘油增強(qiáng)EPCs p-eNOS (Ser1177)、p-Akt (Ser473)的表達(dá),20.0mg/L時(shí)抑制其表達(dá),上述藥物均對(duì)eNOS (Ser1177)、Akt (Ser473)的表達(dá)無(wú)明顯作用(圖6)。說(shuō)明硝酸甘油在適量濃度釋放適量NO但細(xì)胞活性氧(主要是過(guò)氧化亞硝基陰離子)產(chǎn)生未過(guò)量,此時(shí)NO的生物利用度高,提高eNOS、Akt的磷酸化水平,細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A分泌增加,EPCs增殖活躍,而過(guò)高濃度硝酸甘油釋放過(guò)量NO,細(xì)胞活性氧產(chǎn)生過(guò)多,NO生物利用度降低,抑制eNOS、Akt的磷酸化,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A分泌減少,EPCs增殖能力下降。3.p-巰基乙醇能改善20.0mg/L硝酸甘油對(duì)EPCs增殖的抑制作用,降低高濃度硝酸甘油引起的貼壁細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生,并改善p-eNOS (Ser1177)、p-Akt(Ser473)的表達(dá),但對(duì)Akt、eNOS的表達(dá)無(wú)作用。(見(jiàn)圖5,7)結(jié)論：1.硝酸甘油對(duì)EPCs體外增殖的影響與濃度具有密切的關(guān)系,在適宜濃度下對(duì)EPCs增殖具有促進(jìn)作用,過(guò)高濃度下其作用趨向抑制。2.適量濃度的硝酸甘油提供的外源性NO通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的分泌來(lái)促進(jìn)EPCs增殖作用,高濃度硝酸甘油提供的過(guò)量外源性NO使過(guò)氧化亞硝基陰離子和活性氧顯著增加,損傷細(xì)胞酶系統(tǒng),產(chǎn)生硝酸甘油耐藥,抑制p-eNOS,p-Akt表達(dá),使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A生成減少,抑制EPCs增殖。3.p-巰基乙醇可通過(guò)減輕EPCs的氧化應(yīng)激和改善PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路來(lái)逆轉(zhuǎn)硝酸甘油耐藥。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.4

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