發(fā)布時間：2017-11-16 20:27

  本文關(guān)鍵詞：alas1基因的缺失通過影響鈣離子信號通路導致斑馬魚心臟功能障礙

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【摘要】：血紅素的合成是由八步酶催化的級聯(lián)反應所組成的。反應的第一步是由甘氨酸和琥珀酰輔酶A在5-氨基酮戊酸合成酶(ALAS)的催化下縮合生成5-氨基酮戊酸(ALA)。ALA合成酶有兩種同工酶:ALAS1和ALAS2,分別由基因alas1和alas2編碼。alas1基因是一個管家基因,在所有的組織中都表達;而alas2是一個組織特異性的基因,僅在血紅細胞中表達。alas2基因缺陷會導致先天性鐵粒幼細胞性貧血癥(ADP)。ALAS1是血紅素合成的限速酶,血紅素可以通過反饋調(diào)節(jié)ALAS1來抑制自身的合成。Alas1基因的缺失會影響小鼠的胚胎發(fā)育,純合突變體小鼠只能存活8.5天。但是alas1基因在斑馬魚中的功能尚不清楚。本文利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了alas1基因的突變體來研究這個基因在斑馬魚中的具體功能。我們發(fā)現(xiàn),alas1純合突變的斑馬魚也是致死的,純合突變的斑馬魚能存活11天左右。而且突變體在96 hpf或120 hpf時期表現(xiàn)出明顯的心臟功能的缺陷,具體表現(xiàn)有心包水腫,心肌腫大,心跳緩慢等等。突變體斑馬魚的發(fā)育也比野生型斑馬魚緩慢,具體表現(xiàn)為突變體斑馬魚魚鰾發(fā)育受到影響,在第五天不能自由游動。心臟標記基因的原位雜交結(jié)果表明,在120 hpf時期,cmlc2和vmhc這兩個基因在突變體斑馬魚和野生型斑馬魚的表達位置有明顯的差異。在突變體中,心房排鈉肽基因nppa的表達充滿了整個心臟。這些結(jié)果表明了alas1純合突變體的心臟形態(tài)明顯不同于野生型。為了對alas1純合突變體心臟功能障礙的機制做出更詳細的解析,本文選取52 hpf和120 hpf兩個時間點對野生型和純合突變體進行了轉(zhuǎn)錄組測序的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在120 hpf時期,有許多參與心臟收縮和舒張功能的基因的表達量顯著下調(diào),這說明alas1純合突變體的心臟收縮和舒張功能受到影響。在52 hpf時期負責鈣離子轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因atp2a1l的表達量明顯下調(diào),這個基因的下調(diào)也許是引起alas1純合突變體的心臟收縮和舒張功能障礙的主要原因。細胞實驗結(jié)果顯示血紅素和轉(zhuǎn)錄因子Nrf2a-Mafk都能激活atp2a1l基因的啟動子。拯救實驗也表明了血紅素和alas1 mRNA能夠使突變體的atp2a1l基因的表達水平恢復。這些結(jié)果說明了血紅素通過Nrf2a/Bach1b-Mafk通路參與調(diào)節(jié)atp2a1l基因的表達。卟啉癥(porphyria)是一種由血紅素合成過程中的酶的功能缺陷導致的疾病。血紅素合成過程中第四步反應的催化酶為UROS,該酶的功能缺失會導致先天紅細胞性的卟啉癥(CEP)。本文運用CRISPR-Cas9技術(shù)建立了斑馬魚uros基因缺陷的突變體,作為人類先天紅細胞性的卟啉癥的疾病模型。通過對突變體的表型分析,我們發(fā)現(xiàn)突變體的血紅素含量顯著減少,血紅蛋白含量顯著下降,血紅素合成過程中的代謝產(chǎn)物積累引起了自發(fā)的熒光,同時血紅素合成通路中的相關(guān)基因表達水平異常。此外,顯微注射人的UROS mRNA到突變體胚胎中能夠拯救突變體的表型。本文首次構(gòu)建了斑馬魚alas1純合突變體,發(fā)現(xiàn)alas1純合突變體心臟功能減弱,而且還發(fā)現(xiàn)了血紅素參與調(diào)控的一個新的下游基因。本文還建立了一種人類卟啉癥的斑馬魚CEP疾病模型,為CEP的病理機制研究提供了重要的動物模型,并為治療卟啉癥的藥物篩選工作奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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