本文關(guān)鍵詞：alas1基因的缺失通過影響鈣離子信號(hào)通路導(dǎo)致斑馬魚心臟功能障礙

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【摘要】：血紅素的合成是由八步酶催化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)所組成的。反應(yīng)的第一步是由甘氨酸和琥珀酰輔酶A在5-氨基酮戊酸合成酶(ALAS)的催化下縮合生成5-氨基酮戊酸(ALA)。ALA合成酶有兩種同工酶:ALAS1和ALAS2,分別由基因alas1和alas2編碼。alas1基因是一個(gè)管家基因,在所有的組織中都表達(dá);而alas2是一個(gè)組織特異性的基因,僅在血紅細(xì)胞中表達(dá)。alas2基因缺陷會(huì)導(dǎo)致先天性鐵粒幼細(xì)胞性貧血癥(ADP)。ALAS1是血紅素合成的限速酶,血紅素可以通過反饋調(diào)節(jié)ALAS1來抑制自身的合成。Alas1基因的缺失會(huì)影響小鼠的胚胎發(fā)育,純合突變體小鼠只能存活8.5天。但是alas1基因在斑馬魚中的功能尚不清楚。本文利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了alas1基因的突變體來研究這個(gè)基因在斑馬魚中的具體功能。我們發(fā)現(xiàn),alas1純合突變的斑馬魚也是致死的,純合突變的斑馬魚能存活11天左右。而且突變體在96 hpf或120 hpf時(shí)期表現(xiàn)出明顯的心臟功能的缺陷,具體表現(xiàn)有心包水腫,心肌腫大,心跳緩慢等等。突變體斑馬魚的發(fā)育也比野生型斑馬魚緩慢,具體表現(xiàn)為突變體斑馬魚魚鰾發(fā)育受到影響,在第五天不能自由游動(dòng)。心臟標(biāo)記基因的原位雜交結(jié)果表明,在120 hpf時(shí)期,cmlc2和vmhc這兩個(gè)基因在突變體斑馬魚和野生型斑馬魚的表達(dá)位置有明顯的差異。在突變體中,心房排鈉肽基因nppa的表達(dá)充滿了整個(gè)心臟。這些結(jié)果表明了alas1純合突變體的心臟形態(tài)明顯不同于野生型。為了對(duì)alas1純合突變體心臟功能障礙的機(jī)制做出更詳細(xì)的解析,本文選取52 hpf和120 hpf兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)野生型和純合突變體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在120 hpf時(shí)期,有許多參與心臟收縮和舒張功能的基因的表達(dá)量顯著下調(diào),這說明alas1純合突變體的心臟收縮和舒張功能受到影響。在52 hpf時(shí)期負(fù)責(zé)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因atp2a1l的表達(dá)量明顯下調(diào),這個(gè)基因的下調(diào)也許是引起alas1純合突變體的心臟收縮和舒張功能障礙的主要原因。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血紅素和轉(zhuǎn)錄因子Nrf2a-Mafk都能激活atp2a1l基因的啟動(dòng)子。拯救實(shí)驗(yàn)也表明了血紅素和alas1 mRNA能夠使突變體的atp2a1l基因的表達(dá)水平恢復(fù)。這些結(jié)果說明了血紅素通過Nrf2a/Bach1b-Mafk通路參與調(diào)節(jié)atp2a1l基因的表達(dá)。卟啉癥(porphyria)是一種由血紅素合成過程中的酶的功能缺陷導(dǎo)致的疾病。血紅素合成過程中第四步反應(yīng)的催化酶為UROS,該酶的功能缺失會(huì)導(dǎo)致先天紅細(xì)胞性的卟啉癥(CEP)。本文運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)建立了斑馬魚uros基因缺陷的突變體,作為人類先天紅細(xì)胞性的卟啉癥的疾病模型。通過對(duì)突變體的表型分析,我們發(fā)現(xiàn)突變體的血紅素含量顯著減少,血紅蛋白含量顯著下降,血紅素合成過程中的代謝產(chǎn)物積累引起了自發(fā)的熒光,同時(shí)血紅素合成通路中的相關(guān)基因表達(dá)水平異常。此外,顯微注射人的UROS mRNA到突變體胚胎中能夠拯救突變體的表型。本文首次構(gòu)建了斑馬魚alas1純合突變體,發(fā)現(xiàn)alas1純合突變體心臟功能減弱,而且還發(fā)現(xiàn)了血紅素參與調(diào)控的一個(gè)新的下游基因。本文還建立了一種人類卟啉癥的斑馬魚CEP疾病模型,為CEP的病理機(jī)制研究提供了重要的動(dòng)物模型,并為治療卟啉癥的藥物篩選工作奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54

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