發(fā)布時(shí)間：2017-11-06 04:13

  本文關(guān)鍵詞：血管平滑肌特異性SCAP轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及表型鑒定

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【摘要】：目的：動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一類主要由脂質(zhì)代謝紊亂引起的心血管疾病。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白的裂解蛋白(SREBPs cleavage activating protein, SCAP),與SREBPs形成復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),調(diào)節(jié)LDLr和HMGCoAR的轉(zhuǎn)錄,并參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建血管平滑肌特異性SCAP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠來研究血管過表達(dá)SCAP對血管斑塊形成和細(xì)胞膽固醇代謝的影響。方法：構(gòu)建含平滑肌特異蛋白SM22啟動子與SCAP443位點(diǎn)突變體真核表達(dá)質(zhì)粒SCAP(D443N),采用原核微注射將質(zhì)粒注射到卵泡內(nèi)制備目標(biāo)小鼠,獲得編號為1-8的八只FOUNDER小鼠。運(yùn)用PCR鑒定出SCAP轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。得到的轉(zhuǎn)基因陽性小鼠和C57小鼠進(jìn)行交配繁殖子代,通過PCR鑒定初篩,挑選出轉(zhuǎn)基因陽性小鼠,陽性小鼠保留繼續(xù)與C57小鼠交配五代純化背景。從1、2、5、6、7組(3、4及8號FOUNDER小鼠死亡)中各挑選出PCR初篩為陽性小鼠進(jìn)行Southern blot鑒定進(jìn)一步驗(yàn)證外源性的完整整合,選出SCAP表達(dá)明顯的組別進(jìn)行下一步試驗(yàn)。免疫組化鑒定小鼠主動脈根部SCAP、 SREBP2、LDLr以及HMGCoAR的表達(dá),RT-PCR檢測小鼠主動脈SCAP調(diào)控的相關(guān)基因SREBP2、LDLr以及HMGCoAR等的表達(dá)。表達(dá)最強(qiáng)的組中選出6-8周齡雄性SCAPTg/+(轉(zhuǎn)基因陽性)及SCAP+/+(轉(zhuǎn)基因陰性)小鼠各12只,給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)48周。油紅O染色查看小鼠主動脈脂質(zhì)聚集以及測量斑塊大小。結(jié)果：將質(zhì)粒pGL3-SM22-SCAP的片段,通過原核微注射獲的了8只FOUNDER小鼠；免疫組化觀察到SCAP、SREBP2、LDLr以及HMGCoAR在轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的血管表達(dá)較明顯；轉(zhuǎn)基因陽性小鼠主動脈RT-PCR測得靶基因SREBP2、LDLr以及HMGCoAR的表達(dá)水平較對照組明顯增加。FOUNDER小鼠分別和C57小鼠進(jìn)行交配繁殖至少5代后,篩選出SCAP表達(dá)最明顯的2系小鼠進(jìn)行下一步試驗(yàn)。高膽固醇飲食喂養(yǎng)48周后,SCAP轉(zhuǎn)基因陽性小鼠動脈斑塊形成比較明顯,與SCAP轉(zhuǎn)基因陰性小鼠對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：血管過表達(dá)SCAP可以增加基因SREBP2. LDLr和HMGCoAR的表達(dá)。在高脂喂養(yǎng)下,血管過表達(dá)SCAP明顯促進(jìn)脂質(zhì)的聚集。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5

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本文編號：1147291