本文關(guān)鍵詞：p300和MRTF-A協(xié)同促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin表達(dá)的研究

  更多相關(guān)文章： MRTF-A p300 HUVEC 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

【摘要】：血管生成在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中具有重要作用。VE-cadherin是維持血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性的關(guān)鍵基因,對(duì)血管發(fā)育和血管生成至關(guān)重要。然而目前對(duì)于VE-cadherin的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。MRTF-A作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,在許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展以及血管分化發(fā)育過(guò)程中,對(duì)多個(gè)標(biāo)志性基因發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本論文主要探究了MRTF-A及組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶p300對(duì)VE-cadherin基因的控制作用及作用機(jī)制。本文首先利用小干擾RNA特異性抑制了人源的血管靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中內(nèi)源性MRTF-A的表達(dá),利用matrigel實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾MRTF-A的表達(dá)會(huì)抑制HUVEC形成血管樣結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步利用Real-time PCR和western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：作為維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的VE-cadherin的表達(dá)也受到抑制。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成所必須的重要生長(zhǎng)因子。在干擾MRTF-A表達(dá)的同時(shí)加入VEGF,這種抑制作用表現(xiàn)的更為明顯。上述結(jié)果提示MRTF-A可能通過(guò)靶標(biāo)VE-cadherin調(diào)控HUVEC成血管。通過(guò)對(duì)VE-cadherin啟動(dòng)子的序列分析發(fā)現(xiàn)其上有MRTF-A的結(jié)合位點(diǎn)CArG盒。為證明MRTF-A是否可以調(diào)控VE-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄,構(gòu)建了含CArG盒的VE-cadherin啟動(dòng)子質(zhì)粒,通過(guò)熒光素酶報(bào)告分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MRTF-A對(duì)VE-cadherin啟動(dòng)子有明顯的轉(zhuǎn)錄作用,并且這種轉(zhuǎn)錄激活作用具有濃度依賴(lài)性。將MRTF-A的結(jié)合位點(diǎn)CArG盒突變之后,這種轉(zhuǎn)錄激活作用顯著降低。同時(shí),染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：MRTF-A能夠結(jié)合在VE-cadherin啟動(dòng)子上的CArG盒上,并且結(jié)合作用對(duì)VEGF誘導(dǎo)濃度有著明顯的濃度依賴(lài)性。上述結(jié)果證明了VE-cadherin可以作為MRTF-A的下游靶基因。之前有研究結(jié)果顯示VEGF的刺激可以促使招募組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶p300,p300能誘使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑,從而激活基因轉(zhuǎn)錄。在HUVEC中分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染MRTF-A和p300以及共同轉(zhuǎn)染MRTF-A和p300,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MRTF-A和p300能夠明顯協(xié)同促進(jìn)VE-cadherin的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。ChIP結(jié)果顯示當(dāng)共同轉(zhuǎn)染了MRTF-A和p300之后,MRTF-A與VE-cadherin啟動(dòng)子上的CArG盒的結(jié)合作用明顯增加。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)MRTF-A可以招募p300,從而增強(qiáng)SRF結(jié)合位點(diǎn)附近的組蛋白H3K9, H3K14和H4上的乙酰化程度,從而有利于MRTF-A對(duì)VE-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：MRTF-A p300 HUVEC 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R543
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-22
• 1.1 血管生成9-11
• 1.2 血管生成的調(diào)控11-12
• 1.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白VE-cadherin12-14
• 1.3.1 VE-cadherin的發(fā)現(xiàn)12-13
• 1.3.2 VE-cadherin結(jié)構(gòu)及其特征13
• 1.3.3 VE-cadherin在血管中的調(diào)節(jié)作用13-14
• 1.4 Myocardin家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MRTFs)14-17
• 1.4.1 Myocardin的發(fā)現(xiàn)14
• 1.4.2 MRTFs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)14-16
• 1.4.3 MRTFs在內(nèi)皮分化中的作用16-17
• 1.5 組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(HATs)p300與MRTFs的關(guān)系17-20
• 1.5.1 表觀遺傳學(xué)17-18
• 1.5.2 組蛋白乙�；谵D(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用18-19
• 1.5.3 組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶：p30019-20
• 1.5.4 p300在MRTFs轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到的作用20
• 1.6 研究的目的及意義20-21
• 1.7 研究的主要內(nèi)容21-22
• 2 材料與方法22-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-30
• 2.1.1 材料與試劑22-24
• 2.1.2 常用溶液的配置24-29
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器29-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-47
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 2.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染31-32
• 2.2.3 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR32-35
• 2.2.4 蛋白免疫印記(Western blot)35-36
• 2.2.5 熒光素酶報(bào)告基因分析(Luciferase reporter assay)36-37
• 2.2.6 VE-cadherin啟動(dòng)子的構(gòu)建37-41
• 2.2.7 點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建41-43
• 2.2.8 染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)43-46
• 2.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)46-47
• 3 結(jié)果與討論47-64
• 3.1 在HUVEC中,MRTF-A對(duì)VE-cadherin轉(zhuǎn)錄表達(dá)及功能作用分析47-50
• 3.1.1 在HUVEC中,MRTF-A對(duì)成血管的影響分析47
• 3.1.2 在HUVEC中,MRTF-A對(duì)VE-cadherin的表達(dá)的作用影響47-50
• 3.2 MRTF-A對(duì)VE-cadherin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響50-55
• 3.2.1 VE-cadheirn野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及活性分析50-52
• 3.2.2 MRTF-A促進(jìn)VE-cadherin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的作用分析52-55
• 3.3 MRTF-A和p300能夠協(xié)同增強(qiáng)VE-cadherin的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)55-58
• 3.3.1 MRTF-A和p300協(xié)同促進(jìn)VE-cadherin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)55-57
• 3.3.2 MRTF-A與TSA協(xié)同促進(jìn)VE-cadherin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)57-58
• 3.4 過(guò)表達(dá)p300影響MRTF-A與VE-cadherin啟動(dòng)子結(jié)合的研究分析58-60
• 3.4.1 MRTF-A和MRTF-A協(xié)同促進(jìn)VE-cadherin啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性58-59
• 3.4.2 MRTF-A和p300協(xié)同促進(jìn)VE-cadherin轉(zhuǎn)錄激活的結(jié)合元件分析59-60
• 3.5 MRTF-A和p300通過(guò)對(duì)H3K9、H3K141和H4的乙�；饔脤�(duì)VE-cadherin調(diào)控轉(zhuǎn)錄的分析60-62
• 3.6 討論62-64
• 4 結(jié)論64-65
• 5 展望65-66
• 6 參考文獻(xiàn)66-72
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況72-73
• 8 致謝73

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